桦褐孔菌水提取物对糖尿病豚鼠降低血糖血脂作用的研究

李天洙 许青松 崔 永 延边大学医学部基础医学院(延吉 133000)

桦褐孔菌(Inonotus obliquus,Chaga),主要分布于北纬 45～50度的地区,如北美、芬兰、波兰、俄罗斯、日本等国家和地区,在我国主要分布在黑龙江和吉林省长白山地区,民间广泛用于防治癌症等多种疑难杂症[1]。桦褐孔菌提取物具有很多生物活性,如增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒(主要是 H IV)、抗氧化、抑制血小板聚集、抗炎、抗损伤等作用。本实验通过测定糖尿病豚鼠 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C等糖、脂代谢生化指标及 GK、HM G Co A还原酶表达,初步探讨桦褐孔菌水提取物纠正糖尿病豚鼠糖、脂类代谢紊乱的生物化学机制,为桦褐孔菌的临床应用提供理论依据。

1 实验材料 1.1 动物雄性豚鼠 80只,体重 400～500g,由延边大学医学部实验动物科提供。

1.2 实验用药 桦褐孔菌水提取物,由延边圣林菌业有限公司提供。

1.3 实验试剂 STZ(美国 Sigma公司),蛋白质提取纯化试剂盒(Bioss p1250),GK和 HM G CoA还原酶单克隆抗体(Santa Cruz,USA);其他试剂均应用国产优级纯试剂。

1.4 实验仪器全自动生化分析仪(日立7600),糖化血红蛋白分析仪(Sysmex GT),电泳装置(Bio-rad)。

2 实验方法与结果 2.1 制作糖尿病豚鼠模型 糖尿病豚鼠模型制备采用杨丽萍等方法[2],取 FBG≥8.83mmol/L者作为糖尿病成模标准。取造模成功的糖尿病豚鼠 48只(本实验造模成功 54只),按血糖和体重随机分为阴性对照组(模型组)、桦褐孔菌水提取物小剂量组、中剂量组、大剂量组及阳性对照组(盐酸二甲双胍治疗组),每组各 8只 ,桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃桦褐孔菌水提取物 300mg/kg、600mg/kg、900mg/kg。阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍200mg/kg,正常对照组和糖尿病模型组每天灌胃相同剂量的蒸馏水 1次,连续 8周。实验期间饲以标准饲料、自由饮水及新鲜蔬菜。实验前取眦静脉测定各组 FBG、TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。实验 8周后,各组禁食不禁水 12h,麻醉后心脏取血测量 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C水平,取豚鼠肝脏,蛋白质印迹法测定 GK和 HM G CoA还原酶的表达,以β-actin作为内参对照。

2.2 实验组 FBG和 Hb A1c的变化实验前后相比较,阳性对照组的 FBG水平显著下降 (P＜0.01),桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的 FBG均明显下降(P＜0.05);实验后与阴性对照组比较,阳性对照组的 FBG水平显著下降(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的 FBG均明显下降(P＜0.05),与阴性对照组比较,阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的 Hb A1c均明显下降(P＜0.05),并表现出浓度梯度依赖性。阳性对照组与桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的 Hb A1c水平比较无显著变化,结果见表1。

表1 各实验组实验前后 FBG的比较和实验后 FBG及 HbA 1c的比较(±s)

表1 各实验组实验前后 FBG的比较和实验后 FBG及 HbA 1c的比较(±s)

注:实验前后比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;与阴性对照组实验后比较,◇P ＜0.05,◆P＜0.01。

正常组8 6.27± 0.386.74± 0.34 8.68± 0.65阴性对照组8 11.68±0.9612.27± 0.53 22.32±1.46阳性对照组8 12.09± 1.138.62± 1.52▲◆ 14.63± 1.84◇药物小剂量组8 11.95±1.2911.52± 1.44 20.56±1.82药物中剂量组8 11.38± 1.01 10.21± 1.37△◇ 17.47± 1.73◇药物大剂量组8 12.14± 1.289.69± 1.25△◇ 15.73± 1.59◇

2.3 实验组 TG、TC的变化实验前后相比较,阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 TG水平均显著减少(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 TG水平均明显减少(P＜0.05),阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的TC水平均显著减少(P＜0.01);实验后,与阴性对照组比较,阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 TG水平显著减少(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 TG水平均明显减少(P＜0.05),阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大、中剂量组的 TC水平均显著减少(P＜0.01),并表现为浓度梯度依赖性。结果见表2。

表2 各实验组实验前后 TG、TC的比较和实验后 TG、TC的比较±s)

表2 各实验组实验前后 TG、TC的比较和实验后 TG、TC的比较±s)

注:实验后与实验前比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;与阴性对照组比较,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

TG(mmol/L)TC(mmol/L)分 组n实验前实验后实验前实验后正 常组8 1.59± 0.071.61± 0.05 1.08± 0.361.11± 0.27阴性对照组8 2.01± 0.101.89± 0.08 2.16± 0.052.23±0.13阳性对照组8 1.88± 0.061.47± 0.11▲◆ 2.11± 0.080.87± 0.12▲◆药物小剂量组8 1.91±0.121.79±0.09 2.06±0.141.69±0.09药物中剂量组8 1.93± 0.051.58± 0.07△◇ 1.98± 0.111,41±0.07▲◆药物大剂量组8 1.89± 0.091.36± 0.11▲◆ 2.02± 0.130.89±0.11▲◆

2.4 实验组 LDL-C及 HDL-C的变化 实验前后相比较,阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 LDL-C水平显著下降(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 LDL-C均明显下降(P＜0.05),阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 HDL-C水平显著下降(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 HDL-C均明显下降(P＜0.05);实验后,与阴性对照组比较,阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 LDL-C水平显著下降(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 LDL-C均明显下降(P＜0.05),阳性对照组和桦褐孔菌水提取物大剂量组的 HDL-C水平显著下降(P＜0.01),桦褐孔菌水提取物中剂量组的 HDL-C均明显下降(P＜0.05),并表现出浓度梯度依赖性,结果见表3。

表3 各组实验前后 LDL-C及 HDL-C的比较和实验后 LDL-C及 HDL-C的比较(±s)

表3 各组实验前后 LDL-C及 HDL-C的比较和实验后 LDL-C及 HDL-C的比较(±s)

注:实验后与实验前比较,△(P＜0.05),▲P＜0.01;与阴性对照组比较,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)分 组n实验前实验后实验前实验后正 常组8 0.75± 0.180.71± 0.31 0.45± 0.140.51± 0.23阴性对照组8 2.68± 0.262.57± 0.13 1.74± 0.211.69±0.16阳性对照组8 2.59± 0.141.21± 0.22▲◆ 1.69± 0.140.85± 0.14▲◆药物小剂量组8 2.65±0.292.36±0.21 1.79±0.291.53±0.07药物中剂量组8 2.58± 1.011.96± 0.37△◇ 1.65± 1.011.37±0.23△◇药物大剂量组8 2.63± 0.251.49± 0.29▲◆ 1.71± 0.251.03±0.19▲◆

2.5 各实验组 GK和 HM GCoA还原酶表达的变化 实验后,各实验组 GK和 HMG CoA还原酶表达情况见图 1,桦褐孔菌水提取物中、高剂量组 GK表达高于阴性对照组,表现浓度梯度依赖性。阳性对照组和阴性对照组及正常组比较 GK表达无明显差异,桦褐孔菌水提取物高剂量组 GK表达高于阳性对照组。与此相反,桦褐孔菌水提取物治疗组的 HMG CoA还原酶表达呈浓度依赖性减少,桦褐孔菌水提取物高剂量组的HM G Co A还原酶表达均低于阴性对照组、正常组和阳性对照组表达,其中阴性对照组的 HM G Co A还原酶的表达量最多。

图1 桦褐孔菌水提取物对GK和HMGCoA还原酶表达的影响（蛋白印迹）

3 讨 论 糖尿病是一种内分泌代谢紊乱引起的代谢性疾病,由于胰岛素 /胰高血糖素比值降低,脂肪分解加速,大量脂肪酸和甘油进入肝脏,过多的脂肪酸重新酯化成甘油三酯释放入血,形成高脂血症,酮血症等并发症。糖尿病病人由于体内生长素、肾上腺素、去甲肾上腺素等激素增多,使胆固醇合成的限速酶-HMG CoA还原酶增加,胆固醇合成增加,增加了动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性。己糖激酶是葡萄糖分解的关键酶,共有四种亚型,其中存在于肝脏中的己糖激酶称为葡萄糖激酶。葡萄糖激酶的表达受 PPARγ等因子的调节作用[3],在保持血糖的稳定方面起着重要作用。为了探讨桦褐孔菌对糖尿病豚鼠降糖、降脂过程的影响,实施了本次实验。本实验利用豚鼠制作 STZ糖尿病模型,基于 STZ具有能够直接破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭,对其他组织毒性相对较少,实验动物存活率高的特点,及豚鼠和其他啮齿类动物比较,具有对药物非常敏感的特点。实验生化指标测定结果表明,桦褐孔菌中、高剂量组的 FBG、HbA1c、TG、TC、LDLC和 HDL-C水平明显减少,并且具有浓度梯度依赖性,提示桦褐孔菌提取物对糖尿病豚鼠的降低血糖及血脂具有较好的疗效,这些内容和张香花等研究结果吻合[4,5,6]。蛋白质印迹结果表明,桦褐孔菌可增强 GK表达,降低 HMGCoA还原酶表达。推测,GK表达增强,对降低血糖具有促进作用,而血糖水平的改善,可以通过影响体内多种激素的代谢,改变 HMGCoA还原酶的表达水平,减少胆固醇的合成。桦褐孔菌含有三萜类、类固醇、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、鞘氨脂类似物、甘露醇、半单宁化合物、栓菌酸、生物碱、叶酸衍生物以及芳香物质等多种化学成分。桦褐孔菌提取物能够影响 GK和 HMGCoA还原酶表达,是否和这些单体成分有关,这些成分是否以单体或复合体的形式参与这些蛋白质表达的信号传导通路或转录调节过程,还有待于进行其他的相关实验加以确定。以上分析可以推测,桦褐孔菌水提取物对糖尿病豚鼠降低血糖、血脂水平具有较好疗效,其机制之一可能是通过对 GK表达的影响,降低血糖水平,影响体内相关激素水平,进而通过改变 HMGCoA还原酶表达或单独影响 HMGCoA还原酶的表达,达到防治糖尿病的目的。

[1]黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌 [J].中国食用菌,2002,21(4):7-8.

[2]杨丽萍,周文江,卫志明.链脲佐菌素诱发豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海实验动物科学,2001,21(2):111-112.

[3] So-younKim,Ha-ilKim,Sang-KyuPark,etral.LiverGlucokinaseCanBeActivatedbyPeroxisome Proliferator-ActivatedReceptor-γ,DIABETES,2004,53(S1);S66-S70.

[4] 潘艳玲,凌湘力.芪荷地黄汤防治糖尿病脂代谢紊乱的实验研究 [J].陕西中医,2008,29(9):1245-1246.

[5]杨景锋,赵天才,白海侠,等.抵当四五汤对糖尿病血管病变大鼠血液流变性的影响 [J].陕西中医,2008,29(8):1077-1078.

[6] 张香花,孙东植,陈海月,等.桦褐孔菌提取物对糖尿病大鼠生化指标的影响[J].中国食用菌,2008,27(5):41-43.