化浊通脉散对家兔ASO模型血清及组织中TXB2、ET影响的实验研究*

李慎贤，吴洪雷

（中国医科大学附属盛京医院中医科，沈阳 110004）

下肢动脉粥样硬化闭塞症（ASO）是一种常见的周围血管疾病。研究表明，长期的高脂饮食及物理化学因素等刺激，加速了全身动脉硬化的形成，而ASO的形成和发展是长期动脉硬化的结果，本实验通过高脂饮食喂养家兔及股动脉血管内膜造成机械性损伤模拟ASO，以化浊通脉散干预检测实验前后家兔的生化指标及电镜观察局部血管内皮细胞形态，以探讨化浊通脉散对其影响及作用，结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 新西兰大耳白兔40只，4月龄，体质量2.5～2.8 kg，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2003－0013。

1.1.2 实验药物 化浊通脉散组成:黄芪50 g，赤芍20 g，川芎 20 g，当归 20 g，地龙 20 g，红花 10 g，川牛膝10 g，水蛭 10 g，泽泻10 g，焦山楂20 g，由三九药业集团提供，批号：0807021；阿司匹林：由沈阳奥华制药有限公司生产，批号：080606；胆固醇：由国药集团化学试剂沈阳有限公司提供，批号：F20071220；牛血清白蛋白注射液：由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，批号：20080815。

1.1.3 实验试剂与仪器 主要试剂：血栓烷素（TXB2）、6-酮-前列腺素 F1α（6-Keto-PGF1α）、内皮素（ET）试剂盒均由北京北方生物技术研究所提供，批号：20090210；一氧化氮（NO）试剂盒由南京建成生物研究所提供，批号：20081030。主要仪器：中健GC1500-r放射免疫计数器由中国医科大学附属第一临床医院放免科提供。JEM-1200ER透射电子显微镜（TEM），由中国医科大学电镜室提供；酶标仪2010，奥地利安托斯仪器公司，由中国医科大学附属第四临床医院实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组 实验前适应性喂养1周，排除饮食异常者。1周后随机分为4组，每组10只：即化浊通脉散组（A），阿司匹林组（B），模型组（C），假手术组（D），分笼饲养。D组喂养普通饲料，自由饮水。其余3组自实验开始喂高脂饮食（正常饲料中加胆固醇1 g，猪油5 g），共喂养12周。其中实验开始第3天对全部家兔以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉，行左侧股动脉插管，在大腿近端沿左股动脉走行处，钝性分离出股动脉约2 cm，动脉壁上剪一小口后插入球囊至大腿近端处，球囊反复牵拉8次，以确保内膜损伤，退出导管，庆大霉素稀释液冲洗伤口。逐层缝合皮下组织和皮肤。术后肌肉注射庆大霉素8万U一次预防感染。手术后第4天A、B、C组静脉注射牛血清白蛋白250 mg/kg；D组注射等量的生理盐水。第13周开始A、B、C 3组均改为普通饲料喂养，A组予化浊通脉散7.2 g/（kg·d）混入饲料（药物均根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算[1]）；B组给予肠溶阿司匹林12.6 mg/（kg·d）混入饲料中；D组继续给予普通饲料喂养，C、D两组均未加任何药物；在以上条件下共喂养3周。

1.2.2 各实验指标测定及方法 造模前与实验结束时分别取兔耳缘静脉取外周静脉血2 mL，均以2500 r/min离心30 min，取得血清。应用放射免疫γ计数器，采用放免法分别检测TXB2、6-Keto-PGF1α、ET；应用酶标仪以硝酸还原酶法测NO，比较各组数值造模前后及组间的变化。

1.2.3 取材及局部血管高倍透射电子显微镜（TEM）观察 实验结束后，取血清的同时，应用麻醉法处死全部动物，切取左髂股动脉2～3 cm，纵行切开，切取0.5 cm经5%戊二醛溶液固定，1%锇酸固定后，梯度乙醇脱水，树脂包埋，备TEM观察。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理，采用方差分析，所有实验数据以±标准差（x±s）表示，用 SNK-q Test进行组间比较，P<0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 生化检验结果 造模前 NO、ET、6-Keto-PGF1α、TXB2各组比较无明显差异（P＞0.05）。实验结束后，A组与B组、C组相比较：NO及6－Keto－PGF1α 明显高于 B、C 两组（P＜0.01），且 A 组高于B 组（P＜0.01），说明化浊通脉散具有升高 NO 及 6－Keto－PGF1α的作用，且作用优于阿司匹林，而ET及 TXB2明显低于 B、C 组（P＜0.01），说明化浊通脉散具有降低ET及TXB2的作用；A组与D组相比，A组 6－Keto－PGF1α 低于 D 组，（P＜0.01），TXB2高于D 组（P＜0.01），具体数据详见表 1。

表1 各组动物血生化比较(±s)Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes in various groups(±s，n=10)ng/L

表1 各组动物血生化比较(±s)Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes in various groups(±s，n=10)ng/L

注：A组与B组、C组，有显著性差异，*P＜0.01；A组与B组、C 组，有显著性差异，△P＜0.01；A 组与 D组，有显著性差异，#P＜0.01。

组别A组B组C组D组治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后NO（U/mL）165.39±5.52123.11± 5.65*△#166.08±7.8295.22±4.42165.53±8.3765.15±3.68166.15±9.89110.94±13.28 ET 108.22±7.06155.54± 6.41*△#113.60±6.58179.43±11.18△#112.95±5.12225.73±8.59111.39±4.70124.61±6.846-Keto-PGF1α 439.80±9.74351.16±17.46△#441.54±13.21305.98±18.80#433.80±16.91266.01±15.36437.66±7.53403.03±13.56 TXB2267.99±10.55384.64±18.95*△#275.37±12.37533.37±26.29#272.74±9.27620.70±20.26270.76±11.59343.25±27.94

2.2 电镜观察结果 A组内皮下有脂质沉积，内膜不平，中膜平滑肌细胞之间均有脂质空泡，但与B组及C组相比数量较少。B组内皮结构不完整，平滑肌细胞间有少量的泡沫细胞，数量较C组减少。C组未见完整的内皮结构，下有脂质沉积形成的脂质空泡，大量的脂滴堆积，平滑肌细胞间均有脂质空泡，部分细胞中出现大量次级溶酶体和空泡，中膜形成的脂质空泡较内膜增加。D组正常髂股动脉部血管组织内皮细胞连续，细胞形态完整，中膜层未见明显的泡沫细胞。见图1。

3 讨论

一氧化氮（NO）和内皮素（ET）是两种最重要的内皮源性血管活性因子。ET是具有血管调节作用的重要血管活性肽，有强大的收缩血管、促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和促进细胞外基质积聚、加速生长因子、黏附分子等合成与释放及其调节其他基因表达等多种生物学作用。NO为重要的扩血管物质，乙酰胆碱、缓激肽、组胺等的舒血管作用均由其介导，可抑制血栓形成，改善血管重塑，刺激内皮细胞生长等[2]。ET/NO的平衡对全身和局部血流调节起着十分重要的作用，该比值的失衡与动脉粥样硬化（AS）的发生有关[3]。

再者，血小板合成的TXB2具有强烈的收缩血管和促进血小板聚集的作用，而由血管内皮细胞合成的前列环素（PGI2）则作用完全相反，这一对相互拮抗物质的平衡调节，影响甚至决定着血管内皮细胞和血小板的关系，两者的平衡失调是动脉粥样硬化发病的重要。本实验研究表明，化浊通脉散具有升高NO、6-K及降低ET、TXB2的作用，NO/ET调节其动态平衡，减少血管收缩与血小板凝聚，从而达到抗AS的作用。

在本实验中形成的家兔AS斑块病变，有增殖的平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等。平滑肌细胞形成的结缔组织基质，包括胶原、糖蛋白、弹力纤维蛋白。积蓄的脂质主要是游离或酯化的胆固醇，周围被基质包绕等典型改变[4]。实验结束后，TEM观察发现A组，内膜不平，平滑肌细胞之间有少量的脂质空泡，但与B组及C组相比，中药干预优于后两者，说明化浊通脉散对预防脂质沉积及修复破损内皮细胞有一定疗效。

ASO属中医学“脉痹”、“脱疽”等范畴，其病发生多与痰浊凝滞、气虚血瘀有关。《灵枢·营卫生会》有云:“老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩。”人到中老年，元气不足，脏腑功能减退，加之外邪、膏粱伤之、思虑过度，而易生痰成饮，无力运化，阻滞脉道，气血运行受阻，肢体失于温煦、濡养而出现发凉、麻木、跋行、疼痛、甚至溃疡、坏疽的表现。王清任《医林改错》中云:“元气既虚，必不达于血管，血管无气，必停而留瘀。”可见气虚、血瘀、痰浊贯穿本病发病的全过程。因此在治疗上以益气活血、化浊通脉为大法[5]，组成化浊通脉散，重在活血而不破血，益气而不补气；益气充其年老体虚，活血通其经脉，化浊祛其痰瘀，通过培植自身正气调动人体各项功能，达到扶正祛邪、治病求本的目的。本方重用黄芪益气，推动气血运行，并激发脏腑功能活动，使气血生化有源；当归重在养血活血祛瘀通脉；两药合用可宣通气血共为君药。地龙、水蛭、红花、赤芍活血散瘀通经，现代医学研究具有抗凝作用，防止血栓形成；泽泻、焦山楂泄湿化浊，有降血脂作用，两组共为臣药。牛膝引药下行直通下肢，兼以活血，为左使药；全方共奏益气活血、化浊通脉之功效。通过本实验研究证实化浊通脉散具有防治ASO的作用。

[1] 徐淑云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：202-203.

[2] 周京红.一氧化氮和动脉粥样硬化[J].生物技术通讯，2007，05(08):879-881.

[3] 薛迎生，王景峰，聂如琼，等.四逆汤对兔球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20(4):603－608.

[4] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s[J].Nature，1993，362：801-801.

[5] 杨爱东，郭永洁，余 星，等.益气活血通脉颗粒对动脉粥样硬化模型家兔NO、ET、bFGF的影响[J].上海中医药大学学报,2003,17(1):51-53.