消岩汤药物血清对A549/DDP多药耐药逆转作用的研究*

张 莹 ，贾英杰，杨 洁 ，李小江

（1.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，天津 300193；2.天津中医药大学硕士研究生，天津 300193）

肿瘤细胞的多药耐药性（multidrugresistance，MDR）是肿瘤细胞产生的一种特殊的耐药现象，是导致化疗失败的重要原因，并且也是肺癌化疗缓解后复发和转移的重要原因。当前肺癌死亡率已经居恶性肿瘤第1位[1]，由于铂类药物是肺癌联合化疗中的核心，且顺铂是当前对肺癌患者单制剂化疗及联合化疗效率较高的药物之一，因此探讨顺铂的多药耐药对肺癌化疗具有相当大的指导意义。本研究拟以耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP及其亲代细胞系A549为研究对象，探讨消岩汤含药血清对化疗药物多药耐药的逆转作用，为肿瘤MDR的逆转开辟崭新的途径。

1 材料

1.1 药物 将消岩汤于旋转蒸发器上浓缩成每毫升相当于原生药材1.5 g的药液。

1.2 动物 昆明种小鼠60只，雄性，体质量（20.99±1.87）g。

1.3 瘤株 S180（腹水瘤）瘤株，由天津药物研究所提供。

1.4 主要试剂与仪器 新生胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）、顺铂（锦州九泰药业有限责任公司生产，10 mg/瓶，批号：090601）、超净工作台（苏州净化设备公司）、BB5060UVCO2细胞培养箱（德国Heraeus公司）、Model680酶联免疫分析仪（Bio－RAD公司）等。

1.5 细胞系 人肺腺癌细胞系A549：由天津市药物研究所提供；耐顺铂（DDP）肺腺癌细胞系A549/DDP：购自中国科学院肿瘤研究所。

2 方法

2.1 荷S180肿瘤小鼠模型制备：小白鼠适应性饲养3天后，称重，根据随机数目表随机分为高剂量组、低剂量组、模型空白对照组，共3组，每组20只。体外复苏、培养S180细胞，在细胞的对数生长期收集细胞。用生理盐水稀释，调整细胞浓度到1×109cell/L。每只小鼠右前腋下皮下接种0.2 mL[2]。

2.2 给药方法与剂量：小鼠于接种S180肿瘤细胞24h后，高剂量组按消岩汤40 g/kg灌胃给药；低剂量组按消岩汤20 g/kg灌胃给药；模型空白对照组以0.4mL生理盐水灌胃。每次灌胃间隔24h，连续10d。

2.3 观察指标

2.3.1 小鼠生活状况观察 实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。

2.3.2 小鼠体质量变化情况 于给药前给每只小鼠称质量，于末次给药后24 h再次称质量。记录数据，分析。

2.3.3 肿瘤抑制率 小鼠末次给药24 h后，用眼科剪分离完全剥取肿瘤组织，剔净周围结缔组织，电子天平称质量。计算抑瘤率。抑瘤率＝（模型空白对照组平均瘤质量—给药组平均瘤质量）/模型空白对照组平均瘤质量×100%

2.4 细胞培养与传代 参照刘文哲等人[3]介绍的方法并加以改进。倒置显微镜下观察到细胞长满时，以1/10、1/20的细胞传代，培养瓶置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每2～3 d传代1次。

2.5 细胞悬液的制备 取对数生长期A549、A549/DDP细胞，加入适量的0.25%胰蛋白酶液消化，PBS洗涤2次，离心，弃上清液，用RPMI-1640培养液配制成2×105/mL细胞悬液，用于实验。

2.6 MTT法检测A549/DDP细胞的耐药性 将两株细胞的悬液接种于96孔培养板中，每孔细胞数2×103个。第一组为实验组，分别加入终浓度为10、20、40、80、100、200 μmol/L 的顺铂，终体积为 200 μL，每浓度组设5个复孔。第二组为阴性对照组，细胞培养体系中不加药物。第三组为空白调零组，仅加等体积的培养液。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，取每5个重复孔OD值的平均数，计算细胞的增殖抑制率，用Sigmaplot 10计算药物半数抑制浓度（IC50），耐药倍数=耐药株IC50值/敏感株IC50值。

2.7 MTT法检测消岩汤含药血清对A549及A549/DDP的细胞毒作用 参照詹茂程等人[4]的方法并加改进，将细胞分为6组，用酶标仪测OD550检测各孔吸光度，用下列公式计算肺癌细胞在各种浓度下的细胞死亡率及耐药逆转倍数。

2.8 统计学方法 使用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用单因素方差分析，计数资料使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 荷瘤小鼠生活状况观察 自5 d后空白模型对照组小鼠一般状况变差，逐渐出现精神萎靡、行动迟缓、倦怠，毛发干涩，进食减少，而同期的消岩汤高剂量组及低剂量组小鼠一般状况明显优于空白模型对照组小鼠。

3.2 消岩汤对小鼠S180移植肿瘤生长的影响 3组在瘤质量和去瘤后体质量有显著差异（P＜0.05）；高剂量组与低剂量组在瘤质量与抑瘤率方面有显著差异（P＜0.05）。说明消岩汤能对抗荷瘤小鼠体质量减轻，并且能有效缩小荷瘤小鼠瘤体，其抑瘤作用与剂量成正相关。见表1。

表1 消岩汤对接种S180昆明小鼠抑瘤作用比较(±s)Tab.1 Comparison of inhibitive effects of Xiaoyan Tang-containing serum on tumor growth in KM mice(±s)

表1 消岩汤对接种S180昆明小鼠抑瘤作用比较(±s)Tab.1 Comparison of inhibitive effects of Xiaoyan Tang-containing serum on tumor growth in KM mice(±s)

注：*经秩和检验，三组比较，P<0.05；经t检验，低剂量组与高剂量组比较，P<0.05；**经χ2检验，高剂量组与低剂量组比较，P<0.05；***经秩和检验，三组比较，P>0.05。

组别 动物数高剂量组低剂量组模型空白对照组191817瘤质量（g）*1.26±0.151.76±0.142.44±0.45抑瘤率（%）**48.3627.87-动物体质量（始）（g）***20.82±1.0520.66±2.3721.45±2.12动物去瘤后体质量（终）（g）*21.98±2.1919.85±3.4518.78±5.09体质量变化（g）1.16-0.81-2.67

3.3 A549/DDP细胞耐药性的鉴定 通过MTT法增殖动力学的实验对A549/DDP细胞耐药性进行了鉴定。实验中MTT结果示A549及A549/DDP细胞对DDP 的 IC50值分别为 14.77 μmol/L，163.79 μmol/mL，耐药倍数为11.09。证实此肺腺癌细胞系A549/DDP相对于其亲本细胞系A549，确实对传统化疗药顺铂产生明显的耐药性，因此认为该细胞是一株生长良好的耐药系，适合用于后继实验研究。

3.4 消岩汤含药血清对A549及A549/DDP的细胞毒作用 当消岩汤荷瘤动物含药血清高、低剂量组分别与DDP合用时，明显提高了DDP对A549的杀伤作用；当消岩汤荷瘤动物含药血清高、低剂量组分别与DDP合用时，对耐药细胞A549/DDP的杀伤作用更加明显，且能增强DDP对肺癌敏感细胞和耐药细胞的杀伤作用，具有耐药逆转作用。结果见表2。

表2 消岩汤含药血清对A549及A549/DDP的细胞毒作用比较Tab.1 Comparison of cyto-toxicity of Xiaoyan Tang-containing serum on the A549 and A549/DDP

4 讨论

为解决肿瘤多药耐药的问题，许多学者致力于寻找MDR逆转剂，如tariquidar XR9576等，但这类药物毒副作用明显，效果不理想，目前还没有一种药物或方法在临床被广泛接受。因此，笔者试图从中草药中寻求复方以逆转MDR。

消岩汤是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中医肿瘤治则基础上依据现代药理研究研制出的院内制剂，具有多种抗肿瘤活性，在临床应用10余年。经临床实践证实，消岩汤治疗非小细胞肺癌的良好辅助用药[5]。本研究证实消岩汤可防止肿瘤恶液质机体消瘦，并能有效缩小瘤体，增加抑瘤率，具有扶正抑瘤作用；其对肺癌耐药细胞的杀伤作用较敏感，不但能杀伤肺癌耐药细胞，还能增强化疗药物对耐药细胞的杀伤作用，具有逆转耐药作用，从而为中医药治疗肺癌的临床应用提供了重要的实验依据。

[1] Parkin D M,Bray F B,Pisani P.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.

[2] 徐淑云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2005∶1757-1766.

[3] 刘文哲，李金瀚，胡义德，等.顺铂诱导人肺腺癌A549细胞系多重抗药性的形成[J].中国肿瘤临床与康复，1999，6(1)：13-16.

[4] 詹茂程，刘叙仪，蔡 鹏.耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP耐药机理进一步探讨[J].中国肿瘤临床，1998，25(10)∶726-728.

[5] 贾英杰，张 莹，孙一予，等.消岩汤不同时段参与化疗治疗非小细胞肺癌临床疗效观察[J].天津中医药大学学报，2006，25（3）：164-165.