接种根瘤菌与施肥对岷山红三叶异黄酮含量的影响

孟祥君,俞联平,程文定,王国生

（甘肃省草原技术推广总站,甘肃 兰州 730010）

①红三叶Tri folium pratense为豆科车轴草属[1]多年生牧草,又名红车轴草、红荷兰翅摇、金菜花、红花苜蓿等。红三叶中富含异黄酮类化合物,具有抗肿瘤（胃癌、乳腺癌）,防治骨质疏松、改善更年期综合症等作用[2],具有较高的药用价值。岷山红三叶作为甘肃省具有地域特点的优良豆科牧草和药用植物,不仅产量高、品质优,且富含异黄酮,经甘肃省草原技术推广总站化验室检测,岷山红三叶中异黄酮含量为1.0%～2.6%,是大豆异黄酮（0.1%～0.3%）的近10倍[3],同时由于其传统自然的生产方式,不存在转基因问题和除草剂、杀虫剂等污染,符合安全无公害生产的要求,存在巨大的药用价值和绿色保健品开发潜力。

异黄酮作为豆科作物生长过程中形成的一类次生代谢产物,其含量受植物本身、温度、肥力等许多因素的影响,如紫外线辐射、磷素缺乏、长期冷冻处理等都可有效刺激豆科作物异黄酮合成[4]。

接种专用根瘤菌是提高紫花苜蓿Medicago sativa等豆科牧草产量及品质最重要的方法之一。据统计,全球每年生物固氮量达1.75×108t,为世界工业氮肥产量的4.37倍[5],目前美国有80%的紫花苜蓿在种植之前进行根瘤菌接种,在加拿大和澳大利亚,紫花苜蓿接种根瘤菌技术已经被普遍接受[5]。接种根瘤菌将成为未来提高豆科牧草产量和品质,改善和提高土壤肥力的重要农艺措施。然而针对红三叶等豆科牧草药用价值开发,目前还没人就根瘤菌及其接种方式对豆科牧草异黄酮含量的影响进行专题研究。

试验采用L9（34）正交设计,立足岷山生态气候和土壤条件,研究不同根瘤菌梯度、接种方式和氮肥梯度对岷山红三叶异黄酮含量及单位面积产量的影响,对指导甘肃省药用红三叶生产具有重要的生产指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验地概况试验在甘肃省定西南部特优牧草种子基地（岷县奔直寺,34°17′N,104°02′E）进行,该基地海拔2 492 m,年平均气温5.7℃,年均降水量600 mm,无霜期112 d,年均日照时数2 229.6 h,≥10℃年有效积温1 771℃·d。土质为亚高山草甸土,有机质含量为1.43%,总氮0.2%,速效磷12 mg/kg,pH值6.7,适宜种植红三叶、猫尾草Phleum pratense等优良牧草。

1.2 试验材料试验用牧草品种选用岷山红三叶（Mingshan）。氮肥为尿素（兰州化工厂生产）。接种根瘤菌由北京森迪科技产品开发公司提供（每克含菌量200亿）。

1.3试验设计与方法采用L9（34）正交试验设计,进行根瘤菌梯度（A）、接种方式（B）和氮肥梯度（C）三因素,在3个不同水平的组合,对岷山红三叶异黄酮含量和单位面积异黄酮产量的影响,试验共设9个处理,每个处理各设2个重复,共18个小区（表1）。另设一列D为空列,未安排试验因素,其作用是反映试验误差。小区面积3.0 m×4.0 m。

施氮处理：由于当地土壤有机质和氮素含量较高,土壤比较肥沃,播种前试验地均未施氮肥,播种时,尿素一次性施于小区土表后耙地,耧耙深度2～3 cm。

根瘤菌处理：1）播种时将根瘤菌施于土表后耙地；2）播种时将根瘤菌稀释2倍,和种子拌匀,开沟撒播后覆土；3）深2 cm处施入根瘤菌后播种。

表1 L9（34）正交设计表

1.4 播种及田间管理2007年5月16日播种,行距40 cm,条播,播种量 18 kg/hm2,常规田间管理。

1.5 异黄酮含量和单位面积异黄酮产量的测定2008年7月20日,采集盛花期岷山红三叶的植物地上部分,干燥箱烘干,粉碎,过40目网筛。采用紫外分光光度法[6-7],在波长260 nm处对岷山红三叶异黄酮含量进行测定。

盛花期每小区随机选取1 m×1 m样方刈割,自然风干,称取风干质量,换算成单位面积产量（kg/hm2）。利用盛花期单位面积岷山红三叶产量及该时期各处理异黄酮含量计算单位面积异黄酮产量。

1.6 数据处理应用SPSS软件（13.0版）进行正交试验方差分析。

2 结果与分析

2.1 直观分析L9（34）正交试验测定结果见表2。由表 2直观分析可知,RA（1.34）＞RC（1.08）＞RB（0.89）＞RD（0.52）,说明 A 、B、C三因素对指标的影响是确定的,且A因素是影响异黄酮含量和产量的主要因素,其次为C因素。

2.2 异黄酮含量分析各处理方差分析结果见表3。分析结果显示,A因素（根瘤菌梯度）对岷山红三叶异黄酮含量存在显著影响（P＜0.05）,以A2（16 g/kg）水平组最高,A2显著高于A1（0）和A3（32 g/kg）水平组,分别较A1和A3水平高29.1%和33%,A2和A3之间差异不显著（P＞0.05）,说明在岷山红三叶生产中,接种适宜数量（16 g/kg）的根瘤菌对提高岷山红三叶异黄酮含量具有一定的作用；接种方式对岷山红三叶异黄酮含量的影响差异不显著,但具有依表施（B1）、拌种（B2）、深 2 cm处施入（B3）根瘤菌的次序增加的趋势,以深2 cm处施入根瘤菌效果较好；氮肥对岷山红三叶异黄酮含量也不存在显著影响,与 C1（0）组相比,C2（42 kg/hm2）组具有降低的趋势,而C3（84 kg/hm2）组异黄酮含量与C1相近。

2.3 单位面积异黄酮产量分析各处理单位面积异黄酮产量分析结果见表3。

表2 正交试验测定结果

表3 不同处理方式各生产指标方差分析结果表

试验结果表明：接种根瘤菌对岷山红三叶单位面积异黄酮产量有显著影响（P＜0.05）,以A2水平组最高,A1水平组最低,A2显著高于A1水平组 ,较 A1高 53.02%,较 A3高 22.94%,而 A3与A1和A2之间差异均不显著；接种方式、氮肥施用量对岷山红三叶单位面积异黄酮产量无显著影响,其中B2和B3组单位面积异黄酮产量相近,较B1组高 。

2.4 最优水平组合选择以上分析结果表明：接种根瘤菌对岷山红三叶异黄酮含量和单位面积产量均存在显著影响（P＜0.05）,并且都在A2（16 g/kg）水平组异黄酮含量和单位面积产量最高；虽深2 cm处施入根瘤菌异黄酮含量较高,但拌种方式可获得较高的单位面积异黄酮产量,且施用时操作比较方便；在不施氮肥的情况下均能获得较高的异黄酮含量和产量。因此综合考虑根瘤菌梯度、接种方式和氮肥梯度对岷山红三叶异黄酮含量和产量的影响,在岷县自然生态和土壤条件下,以每千克岷山红三叶种子与16 g根瘤菌肥料种,不施氮肥效果较优。

3 讨论

根瘤菌是豆科植物根系上生长的细菌,与豆科植物具有特殊的互利共生关系,宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养,而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。目前豆科牧草与其相应的根瘤菌共生固氮的研究已在紫花苜蓿、红豆草Onobrychris vicaefolia和红三叶等牧草上取得了进展,肯定接种根瘤菌可提高豆科作物的根瘤数和结瘤率（尤其在牧草生长早期）,具有提高豆科牧草产量、改善其营养成分和品质的作用,并能改善和提高土壤肥力[8-11]。然而就根瘤菌及其接种方式对红三叶等豆科牧草异黄酮含量影响的研究目前尚未见报道。该试验结果显示,根瘤菌梯度对岷山红三叶异黄酮含量和单位面积异黄酮产量存在显著影响（P＜0.05）,接种适宜数量（16 g/kg）的根瘤菌对提高岷山红三叶异黄酮含量和产量具有一定的作用。

McMurray等[12]报道,当红三叶缺磷时,芒柄花素含量比施肥处理（23和96 kg/hm2）高；也有试验表明,施氮、磷、钾肥均具有降低豆科牧草中异黄酮含量的趋势[13],不施氮肥或氮肥施用量为75 kg/hm2时,单位面积的异黄酮产量最高[14]。就本试验而言,氮肥施用量为0～84 kg/hm2,与试验所报道[13-14]的0～75 kg/hm2的施用量接近,未表现出明显差异和规律,有必要在更大尺度上做进一步研究。

4 结论

4.1试验结果表明,根瘤菌梯度（A）、接种方式（B）和氮肥梯度（C）对岷山红三叶异黄酮含量和单位面积异黄酮产量影响大小的排列次序为A＞C＞B。接种根瘤菌对岷山红三叶异黄酮含量和产量影响显著（P＜0.05）,以每千克岷山红三叶种子接种16 g根瘤菌效果较好。

4.2接种方式和氮肥梯度对岷山红三叶异黄酮含量和产量不存在显著影响,根瘤菌拌种和不施氮肥均能获得较高的异黄酮含量和产量。

4.3综合考虑根瘤菌梯度、接种方式和氮肥梯度对岷山红三叶异黄酮含量和产量的影响,在岷县生态气候和土壤条件下,药用岷山红三叶生产以每千克岷山红三叶种子施用16 g根瘤菌,拌种,不施氮肥的组合最优。

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