LXR激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺对脊椎动物行为的影响

王小岩，蔡怀涵，余 昊，李小兰，宋 青

（北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系，北京 100083）

肝X受体（LXR）是近年来药物研发的热点之一，其生理调节作用涉及胆固醇、脂肪和糖代谢，与冠心病、2型糖尿病、老年痴呆的发生紧密相关，是治疗这些常见病的药物作用靶点[1-4]。最近研究报道，LXR-623作为首个进入临床人体试验的LXR激动剂，在高剂量组中，实验者出现不同程度的中枢神经系统紊乱症状，表现为头昏、理解能力下降、健忘和偏执意念等[5]。

为避免此类不良反应出现，开发安全的LXR药物，本实验初步建立了简单的动物行为模型，实验动物包括鱼、鸽子和小鼠三种常见的脊椎动物，通过给药LXR激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺（王璐等，未发表数据），进行小鼠旷场（openfield）实验[6]、鸽子自我识别（self-recognition）实验[7]、小鱼躲避天敌实验，观察LXR激动剂对中枢神经的影响，这将为筛选安全有效的LXR调节药物提供研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.1.1 第一批小鼠选用昆明白，雄性，8周龄，10只；第二批选用C57BL21，雄性，8周龄，10只；第三批选用昆明白，雄性，8周龄，40只；小鼠均购于北京大学医学部实验动物中心。

1.1.1.2 鸽子选用16只美国白羽王肉鸽，平均4年，雄雌各半，购于北京市大兴区肉鸽饲养棚。

1.1.1.3 长度为5 cm淡水鱼、直径为10 cm巴西龟，购于北京花鸟鱼虫市场。

1.1.2 实验药品与仪器

猪脱氧胆酸二甲酰胺（由本实验室合成），玻璃鱼缸30 cm×20 cm×30 cm（长×宽×高），摄像头，照相机，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 小鼠旷场行为实验

第一批昆明白小鼠、第二批C57BL21小鼠进行旷场行为实验，给药量均为200 mg/（kg·d）。为了观察群体行为和平行比较，将每批的5只给药组和5只对照组放入旷场实验箱子，对其在中心区域的穿越次数进行计数。第三批选用昆明白小鼠40只，按平均体重分为5组，采取高密度笼养方法（8只/笼），进行旷场行为实验来观察环境压力下的药物作用。

1.2.2 鸽子自我识别实验

在鸽子饮用水中加入LXR激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺，给药量为 200 mg/（kg·d），喂养 16 h 后测试。 测试方式采用观察鸽子对镜面像和其他鸽子的相对关注程度，了解鸽子中枢神经系统活动，包括注意力、对其他个体的好奇程度、主动交流的愿望、敏感性等。实验装置为2个并排的网状笼子，各放一只鸽子，一面放置镜子，其他三面用白纸屏蔽，鸽子可以看见彼此及自己的镜面像。每对鸽子在笼中放置5 min，然后用黑色记号笔在鸽子前部做一个明显的记号，再在笼中放置5 min。整个过程摄制录像保存数据及实验后分析。

1.2.3 鱼躲避天敌实验

鱼躲避天敌实验是通过向水中添加猪去氧胆酸二甲酰胺，使水中猪去氧胆酸二甲酰胺的浓度为20 μmol/L。按照体长挑选出10只，平均分为两组，每组5只，饲养在2个鱼缸中。实验组水中含有猪去氧胆酸二甲酰胺，对照组为自来水。暴露时间为24 h，测试时将实验乌龟放入鱼缸中并录像分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠旷场行为实验

选用不同种系的小鼠（昆明白和C57BL21）做旷场行为实验。实验结果显示，给药组的动物进入中心区的次数多于对照组动物（P<0.05）。 见表 1、2。

2.2 环境压力下的药物作用

为了观察环境压力下的药物作用，本研究采取高密度笼养提高小鼠紧张度，采用旷场实验分析药物作用。结果显示，在高密度笼养的环境压力下笼养18 d后，LXR激动剂改变动物探索行为；但是与标准笼养密度条件下药效相反，服药动物逐渐丧失进入中心区的兴趣，但是统计分析显示无显著差异（表 3）。

表1 昆明白小鼠旷场行为实验结果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

表1 昆明白小鼠旷场行为实验结果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

编号 空白对照组 实验组105229306459549平均次数2.207.60标准方差2.281.95平均进食量（g）9.809.60平均饮水量（g）7.708.80平均体重（g）36.89±2.0432.63±3.15

表2 C57BL21小鼠旷场行为实验结果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

表2 C57BL21小鼠旷场行为实验结果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

编号 空白对照组 实验组128227327454597平均次数4.006.60标准方差3.081.52平均进食量（g）9.0015.60平均饮水量（g）9.1010.90平均体重（g）24.33±0.9125.52±2.54

2.3 鸽子自我识别实验

本实验观察到较为明显的行为差异，服用LXR激动剂的鸽子表现出对镜面像的好奇超出对照组。将鸽子照镜子的行为分类为转头、低头、挪步、转身、梳羽和扇翅。每对鸽子对镜面像的兴趣大于对彼此的兴趣，绝大多数时间与镜面像对视。给药组的鸽子表现出更强的主动交流姿态和举动（表4）。但是在鸽子被标记后（带点），都表现出对镜面像兴趣和自主活动下降的倾向（表5）。

表3 高密度笼养压力下昆明白小鼠旷场实验结果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

表3 高密度笼养压力下昆明白小鼠旷场实验结果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

编号一次服药量[mg/（kg·d）]050 100 200 300191109235100323000400300511200612111700100810100平均次数2.131.501.250.131.25标准偏差2.951.770.890.353.15平均进食量（g）11.9818.8118.8915.1117.84平均饮水量（g）21.6024.6224.1225.7730.12平均体重（g）35.39±2.4433.00±1.0732.00±1.2032.25±1.0430.75±1.39

表4 鸽子自我识别实验结果统计分析（不带点）Tab.4 Pigeon mirror behavior test result(no spot)

2.4 鱼躲避天敌实验

实验中发现给药组的鱼与对照组相比，启动躲避动作的警戒区域明显缩小，表现出对天敌的无畏行为（实验数据未给出）。

表5 鸽子自我识别实验结果统计分析（带点）Tab.5 Pigeon mirror behavior test result(spot)

2.5 LXRα配体结合区的一级结构比对

图1 对比了人（h）、小鼠（m）、斑马鱼和鸡（c）的部分序列，其中红框内的氨基酸残基参与配体结合（<7埃）。

图1 LXRα配体结合区的一级结构比对Fig.1 Alignment of LXRα LBD amino acid sequence

3 讨论

LXR受体基因具有高度的种间保守性[8]。由图1可以看出，这些物种的LXR受体配体结合区域的高度保守性，只有一个残基不同（*号处），而其距配体距离有6埃以上不会直接影响配体结合的特异性。基于上述结构分析可以推断，能够激活人LXR受体的激动剂也可以激活其他物种的LXR受体。

大脑中枢神经系统所含胆固醇比外周组织高出很多[9]。由于血-脑屏障的存在，含胆固醇的脂肪颗粒不能有效进入大脑，所以大脑中95%的胆固醇是原位合成的。人体大脑随年龄增加胆固醇含量逐步下降，而老年痴呆与大脑的胆固醇代谢存在一定的关联性[10]。所以调节中枢神经系统的胆固醇代谢对其生理功能产生影响。LXR受体在中枢神经系统的信号传导表现在多种细胞种类内，包括神经细胞、星状细胞和微星（脑巨噬）细胞[11]。LXR激动剂可以上调ABCA1蛋白[12]、ApoE蛋白[13]，促进细胞内胆固醇向胞外转运，使细胞膜内胆固醇浓度下降。神经细胞的突触结构对细胞膜成分依赖性很强，胆固醇浓度下降可能会影响神经细胞的生理活动。可以推测，外源性高剂量LXR激动剂急性使用，可能会非特异性地降低大脑神经细胞的胆固醇含量，从而影响正常的中枢神经系统功能。

4 结论

本实验使用LXR激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺对鱼、鸽子和小鼠的行为影响做了初步观察。实验结果显示，LXR激动剂急性使用，改变了鱼、鸽子和小鼠的正常行为，从而确定了LXR影响中枢神经系统的药效。临床使用LXR调节剂，应努力减小或避免对中枢神经系统的不良影响。本实验采用的思路可以为安全开发LXR调节剂提供简单可靠的动物行为研究方法。

[1]Fiévet C,Staels B.Liver X receptor modulators:effects on lipid metabolism and potential use in the treatment of atherosclerosis[J].Biochem Pharmacol,2009,77(8):1316-1327.

[2]Wójcicka G,Jamroz-Wis'niewska A,Horoszewicz K,et al.Liver X receptors(LXRs).Part I:structure,function,regulation of activity,and role in lipid metabolism[J].Postepy Hig Med Dosw,2007,61(3):736-759.

[3]Jamroz-Wis'niewska A,Wójcicka G,Horoszewicz K,et al.Liver X receptors(LXRs).PartII:non-lipid effects,role in pathology,and therapeutic implications[J].Postepy Hig Med Dosw,2007,61(3):760-785.

[4]Geyereggera R,Zeydaa M,Stulniga TM.Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(5):524-539.

[5]Arie K,Chandrasekhar U,Elyssa O,et al.Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamics of single doses of LXR-623,a novel liver X-receptor agonist,in healthy participants[J].The Journal of Clinical Pharmacology,2009,49(6):643-649.

[6]Wei XK,Si WC,Yu LL,et al.Effects of taurine on ret behavior in three anxiety models[J].Pharmacology,Biochemistry and Behavior,2006,83(9):271-276.

[7]Helmut P,Ariane S,Onur G.Mirror-induced behavior in the magpie:evidence of self-recognition[J].Plos Biology,2008,6(8):1642-1650.

[8]Reschly EJ,Ai N,Welsh WJ,et al.Ligand specificity and evolution of liver X receptors[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2008,110(1-2):83-94.

[9]谭来勋,孙圣刚.胆固醇与脑和突触可塑性关系的研究进展[J].卒中与神经疾病,2006,13(6):383-385.

[10]Mauricio M,Carlos GD,Maria DL.Brain cholesterol in normal and pathological aging[J].BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids,2010,3(21):311-351.

[11]Whitney KD,Watson MA,Collins JL,et al.Regulation of cholesterol homeostasis by the liver X receptors in the central nervous system[J].Molecular Endocrinology,2002,16(6):1378-1385.

[12]Costet P,Luo Y,Wang N,et al.Sterol-dependent transactivation of the ABC1 promoterby the liverXreceptor/retinoid X receptor[J].J Biol Chem,2000,275(36):28240-28245.

[13]Mak PA,Laffitte BA,Desrumaux C,et al.Regulated expression of the apolipoprotein E/C-I/C-IV/C-II gene cluster in murine and human macrophages[J].J Biol Chem,2002,277(35):31900-31908.