核磁共振内标法测定维生素C片中维生素C的含量

陈春丽，田兰，马晓丽，孟磊，李新霞(新疆医科大学药学院分析测试中心，乌鲁木齐市830054)

维生素C作为维持机体正常生理功能的重要维生素之一，对人体健康有着重要的意义[1]。目前测定维生素C含量的方法很多，主要有滴定分析法、分光光度法、电极法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。其中，滴定法操作简单，但是滴定终点难以准确判断；分光光度法操作费时；高效液相色谱法灵敏度高、选择性好，但前期处理较复杂，定量时需要高纯度物质作对照。

药物的核磁共振定量分析在我国已有多篇报道[2～6]，美国、英国、欧洲等国和地区药典中都已先后引入了核磁共振定量分析方法[7，8]，但有关维生素的相关研究较少。笔者采用核磁共振内标法对维生素C片中维生素C含量进行分析，以期建立核磁共振定量分析维生素C的方法。

1 仪器与试药

Varian unity Inova 600 MHz超导核磁共振波谱仪(美国Varian公司)；Mettler toledo AB135-S型分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；氘代DMSO(美国CIL公司生产，D2O氘代度＞99.8%，DMSO氘代度＞99.9%)；苯(天津市福晨化学试剂厂，分析纯)；维生素C对照品(Sigma公司)；维生素C片(成都锦华药业有限责任公司，批号:070505、070524、070613)。

2 方法与结果

2.1 试验条件

谱仪测定温度:21℃；观察频率:599.951 MHz；谱宽:9599.2 Hz；脉冲宽度(pw):11.65 μs；采样时间(at):2 s；延迟时间(d1):5 s；采样次数(nt):32次。

2.2 供试品溶液配制

2.2.1 优化仪器参数时的样品配置:精密称取维生素C对照品适量，置于5 mm核磁管中，并加入一定体积的内标苯及适量的溶剂氘代DMSO，即可进行1H-NMR谱检测。

2.2.2 定量分析时的样品处理方法:精确称取研磨后的维生素C片粉末适量，置于5 mm核磁管中，并加入一定体积的内标苯及适量的溶剂氘代DMSO，超声15 min，使其充分溶解，即得待测溶液。

2.3 谱仪操作方法

将装有待测样品的核磁管放入谱仪中，调整仪器参数，经认真调谐、匀场、采样得到1H-NMR谱，再进行谱图的相位和基线调整，对样品和内标的定量峰分别进行5次积分，取其平均值，得到积分结果。

2.4 溶剂和内标的选择

维生素C具有烯醇式己糖内酯立体结构，为水溶性化合物，在水中易溶解，但溶剂为D2O时，内标较难确定。本研究选用氘代DMSO为溶剂，苯为内标，其化学式和1H-NMR谱见图1。

由图1可见，样品、溶剂、内标峰完全分离，表明三者未发生化学反应和产生缔合。1H-NMR谱峰归属如下:δ11.03 ppm、δ8.31 ppm分别对应羟基1-H、2-H质子信号，δ7.37 ppm为内标苯的质子信号，δ4.85 ppm为羟基3-H、4-H合并在一起的质子信号，δ4.72 ppm、δ3.72 ppm分别为次甲基5-H、6-H质子信号，δ3.41 ppm为亚甲基-CH2-的质子信号，δ2.51 ppm为溶剂氘代DMSO的信号峰。

图1 以苯为内标时维生素C片在DMSO中的1H-NMR谱Fig 11H-NMR spectra of vitamin C with benzene as internal standard in DMSO

2.5 定量峰的选择

待测药片的1H-NMR谱见图2。由于维生素C片中除了主药外添加了其它辅料，导致谱图中出现干扰峰，但化学位移为δ4.72 ppm处的双峰、δ3.72 ppm处的多重峰受辅料影响不大，因此本试验考虑选择这2种峰作为样品定量峰，积分面积分别为As1和As2。在氢谱中，苯只有一单峰，即为内标定量峰面积积分为Ar，化学位移为δ7.37 ppm。

图2 维生素C片的1H-NMR谱Fig 21H-NMR spectra of vitamin C tablets

2.6 仪器参数的优化方法

2.6.1 pw的选择:不同pw下的As/Ar值见表1。其他仪器参数:nt＝16次，d1＝4 s，at＝1 s。

表1 不同pw对相对峰面积比的影响Tab 1Ratio of pw to As/Ar

由表1可见，随着pw的增加，样品定量峰与内标定量峰的积分面积比值随之增大，因此本试验选取pw＝11.65 μs。

2.6.2 at的选择:不同at下的As/Ar值见表2。其他仪器参数:nt＝16次，d1＝4 s，pw＝11.65 μs。

表2 不同at对相对峰面积比的影响Tab 2Ratio of at to As/Ar

由表2可见，当at＝1～2 s时，所对应的As/Ar值较大，表明FID已衰减完全，故本试验选取at＝2 s.

2.6.3 d1的选择:不同d1下的As/Ar值见表3。其他仪器参数:nt＝16次，at＝2 s，pw＝11.65 μs。

由表3可见，当d1＝5 s时，As/Ar最大，因此本试验选取d1＝5 s。

表3 不同d1对相对峰面积比的影响Tab 3Ratio of d1 to As/Ar

2.6.4 nt的选择:测定不同nt下的As/Ar值见表4。其他仪器参数:d1＝5 s，at＝2 s，pw＝11.65 μs。

表4 不同nt对相对峰面积比的影响Tab 4Ratio of nt to As/Ar

由表4可见，As/Ar随nt增大而增大，nt＞32次后增加趋势不明显，为了节省试验时间、加快分析速度，本试验选取nt＝32次。

2.7 1H-NMR谱内标法测定维生素C

2.7.1 定量方法:从1H-NMR谱中读取样品定量峰和内标定量峰积分面积，并用以下公式计算样品的含量:

其中:As和Ar分别为被测样品和内标物质选定定量峰的峰面积；ns和nr分别为被测样品和内标物质定量峰包含的质子数；Ms和Mr分别为被测样品和内标的摩尔质量；vr为内标的体积。

2.7.2 含量测定。制备含有不同质量药品(批号:070505)的待测样品，分别测定1H-NMR谱，结果见表5。

表5 维生素C含量的核磁共振数据Tab 5The data of the content of vitamin C

由化学位移为δ4.72 ppm处信号峰峰面积As1计算结果为:5份样品中维生素C的含量分别为39.1%、40.2%、39.8%、39.9%、41.4%，平均含量为40.1%，RSD＝1.38%。

由化学位移为δ3.72 ppm处信号峰峰面积As2计算结果为:5份样品中维生素C的含量分别为41.2%、42.3%、41.9%、44.8%、43.5%，平均含量为42.74%，RSD＝3.54%。

2.7.3 重复性试验。取3号样品，在同一试验条件下连续做5个1H-NMR谱，并计算维生素C与内标的定量峰峰面积比值以考察试验的重复性。结果，δ4.72 ppm、δ3.72 ppm处定量峰计算所得RSD分别为0.29%和0.76%，表明重复性较好。

2.7.4 回收率试验。分别在2、3、4、5号样中加入维生素C对照品8 mg，振荡使其充分溶解后测定1H-NMR谱，定量峰确定为δ4.72 ppm处信号，计算回收率，平均值为100.9%。加样回收率试验数据见表6。

批号为070524、070613的样品含量测定方法同上(定量峰δ4.72 ppm处为双峰)，维生素C含量分别为43.6%、42.9%。

3 讨论

由于核磁共振定量分析是以结构分析为基础的分析方法，结构(包括构型和构象)分析、定性分析、定量分析可同步完成，方法自身具有简单、准确、专一性高和不破坏样品等优点。

表6 加样回收率试验数据Tab 6Results of recovery test

1H-NMR谱法中内标的作用不同于常规方法中内标的作用。常规分析方法中，内标的作用是减少最终带入结果的操作误差，而在此方法中，内标是用以定量的依据。本研究曾选择2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸(TSP)作为内标，加入TSP后维生素C中的次甲基峰δ7.36 ppm位移至δ4.80 ppm，几乎与水峰重叠。由此可知，内标TSP与重水发生了缔合，不适合作定量分析。由1H-NMR谱内标法与高效液相定量分析方法相比，样品用量小，前处理方法简单，一般无需分离，定量时无需化合物的纯品作为对照标准，可以对无对照品的药品进行含量分析和质量控制，结构鉴定和定量分析可同步完成，分析速度快。足够的at可以保证自由感应衰减信号衰减完全，从而提高分辨率。而合适的d1可保证谱图强度不会被饱和，有利于对谱峰进行正确的积分。在仪器测试状态调整到最优时，该法准确度和精密度可以接近高效液相色谱法。由本试验数据可知，该法简便、准确，可以用于维生素C的含量分析，也可为后续研究核磁共振定量分析其它药物提供参考。

[1]张石革，孙定人.维生素缺乏症与维生素的补充[J].中国药房，2002，13(6):382.

[2]王强，汪茂田，张志权.核磁共振法定量测定替米考星含量[J].分析测试学报，2003，22(6):101.

[3]刘英，胡昌勤.核磁共振在抗生素药物定量分析中的应用[J].药物分析杂志，2001，21(6):447.

[4]沈文斌，王庆峰，廖海平.药物对映体含量测定的核磁共振法研究Ⅰ.非洛地平[J].药物分析杂志，1996，16(4):230.

[5]沈文斌，张灿，王文庆.四氢小檗碱对映体的核磁共振研究[J].中国药科大学学报，1997，28(3):132.

[6]王庆峰，杭太俊，张正行.核磁共振法测定萘普生对映体相对含量[J].中国药科大学学报，1999，30(1):31.

[7]United States Pharmacopoeia Commission.USP24/NF19:1221～1222.

[8]United States Pharmacopoeia Commission.USP24/NF19:1959～1965.