微核实验方法的比较研究

王宗霞，刘菏月，杨美霞，查 娜，娜布其，阿拉坦其其格

1.包头医学院，内蒙古包头 014040

2.包头医学院基础学院，内蒙古包头 014040

微核实验方法的比较研究

王宗霞2，刘菏月1，杨美霞2，查 娜1，娜布其1，阿拉坦其其格1

1.包头医学院，内蒙古包头 014040

2.包头医学院基础学院，内蒙古包头 014040

微核实验作为快速检测体内染色体畸变的方法，以其简便、迅速、敏感为优点广泛应用于遗传、食品、药物、环境等很多领域.为此，我们对微核实验染色方法、基本实验方法与自动化检测方法进行比较，以提供在不同实验条件和实验目的下应选用的方法。

微核；染色方法；实验方法；比较研究

1 基本染色方法的比较

1.1 基本染色方法

吉姆萨染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。与嗜酸性颗粒结合，染粉红色；与嗜碱性物质结合，染紫蓝色；中性物质，染淡紫色。吖啶橙荧光染色法：荧光色素吖啶橙透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。在荧光镜下吖啶橙使细胞核呈绿色或黄绿色荧光；凋亡细胞中，吖啶橙使凋亡小体呈黄绿色荧光；坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

1.2 染色时间的比较

染色时间对吉姆萨染色效果有影响，时间太短如染色5min～7 min，整个细胞染成浅紫色，效果不明显，发生微核的细胞区分不明显；染色时间太长，则染色太深，会使整个细胞都成深紫色，观察不出细胞膜和细胞核的边界和细胞核分成的小核；染色10 min 效果较好，孙华明等[1]在2个不同时间进行Giemsa 染色, 比较了不同时间染色对结果的影响, 结果差异并不显著。吖啶橙染色的荧光会在短时间内发生淬灭，淬灭会在短时间内对实验结果有一定影响，所以吴娣等实验观测时采用先在镜下对选定视野进行拍照，再在图像上进行细胞计数的方法，能够减少淬灭对结果造成的影响。

1.3 染色方法改进比较

胡冰冰等[2]将丫啶橙显微镜法改进，在干净玻片上滴加AO染液10μL，取骨髓细胞悬液5μl直接滴在染液内,混匀后盖片,在室温（11℃～33 ℃）下可立即计数，效果较好。王襄等[3]通过人外周血淋巴细胞的毛细管法，用瑞氏和染色姬姆萨联合染色（姬姆萨1mL加蒸馏水20mL），瑞氏染色1min, 姬姆萨染10min，效果较好。姚沈明等[4]改进传统的姬-瑞氏混合染色法，（按姬氏、瑞氏、蒸馏水1：3：10 混合均匀）染色5min, 镜下可见淋巴细胞浆染成淡天蓝色, 胞核微核清晰可辨。 吖啶橙AO 常与溴化乙啶EB 合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

2 同一种细胞的不同方法比较

李锐等[5]观察蜘蛛血细胞的微核，采用吉姆萨染色和吖啶橙两种染色方法进行优缺的比较：吉姆萨染色后蜘蛛血细胞的形态结构清晰，细胞膜和细胞核边界清楚，能很好的区分核与胞质，呈现出清晰的细胞图，观察效果好。吖啶橙染色法，它具有特异性强，检出率高，不易受细胞形态学变化的影响等特点。即使细胞的数量较少，以常规染色法难以做出诊断的标本，使用吖啶橙染色时，呈现明亮染色的细胞也容易与暗色的背景区别开来，从而做出明确诊断。该方法的不足之处是以荧光染料染色的标本不易保存，难以作回顾性诊断。要求条件较高，只能在实验室进行。研究结果表明，用吖啶橙染色法的检出率更高，荧光显微镜检查可见典型的凋亡形态。这种方法不仅可看到细胞的形状，而且能同时看到细胞核。是一种较好的染色方法。张艳芬等[6]进行Giemsa染色和DAPI方法比较，DAPI是特异性荧光染料，微核清晰可辨用；普通的Giemsa染色，非特异性，不能排除是Giemsa染液中染色颗粒的干扰，所以，不能确切判断是否为微核。陈秀云等[7]进行Tris-NH4Cl 法和明胶法优缺比较，前者主要是通过低渗溶解作用, 将红细胞破坏来分离淋巴细胞；后者主要是根据比重原理将淋巴细胞分离出来。Tris-NH4Cl 法抗凝血经过低渗处理后, 再经固定液冰醋酸：甲醇= 1：3，固定后, 涂片中细胞沉渣较少, 视野中淋巴细胞较多, 特别便于显微镜下计数, 具有快速、方便等特点，但所需试剂相对较多，成本较高；明胶法细胞形态较完整，所需试剂较少，具有价廉等特点，但操作过程费时，汲取上清液时难免会混入少量的红细胞，因而在油镜视野中淋巴细胞相对较少，计数较困难。从对正常人群的测定结果看，两种检测方法检测结果基本相同，表明两种检测方法均适用于临床检测诊断。所以在进行淋巴细胞微核检测时,应根据各实验室的条件进行。沈宗丽等[8]进行细胞松弛素法（CB）与常规法比较，对测得的淋巴细胞微核直径和微核率作了比较：1）3.1Gy照射, CB法微核率7.517%高于常规6.171%(p＜0.05)；CB法平均微核体积是常规法的1.8倍；2）未照射组中，CB法测的健康人自发微核率0.767%也高于常规法0.492%(p＜0.05)；CB法平均微核体积是常规法的1.6倍。结合文献资料可认为，CB法在检测电离辐射的诱变性上较常规法敏感，实际工作中应有选择地使用CB法。用上述方法，Fenech M测平均MNT,认为CB-MNT比C-MNT敏感。胡冰冰等对流式细胞仪和AO显微镜法的结果比较，可以互相应证实验的准确性。流式细胞仪检测经X射线处理后的小鼠骨髓红细胞微核，显示出良好的剂量及时间依赖性。AO显微镜法检测小鼠骨髓，也呈现出良好的剂量及时间依赖性。用两种方法检测所得的小鼠骨髓fMNPCE的全部数据之间具有正相关性。李志等[9]小鼠网织红细胞微核率变化同时采用PI 和CD71 染色进行流式细胞术检测和外周血涂片 Giemsa 染色显微镜检测。结果：应用流式细胞术检测外周血网织红细胞微核与外周血涂片显微镜检测敏感性相同, 两者并具有良好的相关性。流式细胞术检测法能在3min 内完成10 000个网织红细胞的检测, 常规显微镜检测1 000个网织细胞至少需20 min。流式细胞术检测法具有高通量、省时、省力等优势。

3 不同细胞的同一种染色方法比较

张艳芬等[10]取小鼠外周血、骨髓液和睾丸组织细胞Giemsa染色，分别采用外周血微核检测方法、骨髓微核检测方法及睾丸微核检测方法观察微核。3种方法中，骨髓微核检测法微核很易观察到，实验组和阴性对照组间有极显著差异,且方法方便、稳定，Giemsa染色后效果好，清晰且易辨认；睾丸微核检测法观察到出现微核的细胞较少，实验组和阴性对照组的微核发生率只有显著差异，且Giemsa染色特异性差些,微核不易辨别；实验组微核发生率骨髓微核检测方法高于睾丸微核检测方法；外周血细胞微核检测方法未观察到微核。3种方法中骨髓微核检测方法为最佳。张艳芬对小鼠的股骨和胸骨比较，结果股骨比胸骨好，在收集骨髓细胞时，冲洗骨髓腔比用止血钳挤出骨髓液取材要好。

4 多种方法检测多种细胞的比较

胡冰冰等以环磷酰胺处理雄性KM小鼠，分别用丫啶橙、单激光流式细胞仪、姬姆萨法检测小鼠骨髓及外周血嗜多染、正染红细胞微核率,将检测结果进行比较。结果：以前置角散射光（FSC） 和DNA 荧光（FL1）作图,清晰可见小鼠骨髓细胞被分成5个群体——有核细胞、嗜多染、正染、含微核的嗜多染及正染红细胞; 环磷酰胺诱导的小鼠骨髓嗜多染及正染红细胞微核率呈良好的剂量- 反应关系；FCM、快速AO 法与Giemsa 法检测结果具有良好的相关性。结论：AO-FCM自动化检测方法完全适用于小鼠骨髓红细胞微核率的检测。适用于大批量样本检测，对于小批量或小型实验室检测，可选择快速AO 检测法，该方法与标准Giemsa 法检测结果相关性很好。

[1]孙华明，等.实验误差因素对人双核淋巴细胞微核结果影 响的研究[J].癌变畸变突变，2007(4).

[2]胡冰冰，等.流式细胞仪检测X射线诱导小鼠骨髓红细胞微 核率的初步研究[J].第三军医大学学报，2005(2).

[3]王襄，等.毛细管法检测淋巴细胞微核的结果分析及质量控制[J].职业与健康，2003(7).

[4]姚沈明.淋巴细胞微核染色方法的改进[J].化工劳动保 护，1997(5).

[5]李锐，等.2种染色方法在微核试验中的比较[J].蛛形学 报，2008(2).

[6]张艳芬，等.小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色法[J].中国 组织工程研究与临床康复，2008(2).

[7]陈秀云，等.Tris-NH4Cl 法与明胶法检测外周血淋巴细胞 微核率的比较研究[J].现代预防医学，2007(10).

[8]沈宗丽，等.培养人淋巴细胞分裂阻滞与常规微核测试法 的比较研究[J].癌变畸变突变，1995(6).

[9]李志，等.不同采样时间小鼠网织红细胞微核率变化的流 式细胞术研究[J].现代预防医学，2005(6).

[10]张艳芬，等.3种微核检测方法的比较[J].新乡医学院学 报，2008(3).

Q93

A

1674-6708（2010）28-0110-02

王宗霞，教授，研究方向：生殖生物学

刘菏月、查娜、娜布其、阿拉坦其其格，专业：临床医学，研究方向：生殖生物学

杨美霞 ，讲师 ，研究方向 ：组织胚胎学