大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定

府晓丹，于波，李阳，姜振环，杨滢，孟亮

（中国医科大学 附属第一医院心内科，沈阳 110001）

严重的心率失常可致晕厥、猝死等，安装电子起搏器是这类患者的主要治疗手段。近年来，随着我国心脏疾病人数的逐年增加和人们对生活质量要求的不断提高，需要安装电子起搏器的人数每年都在递增。但电子心脏起搏器在长期应用过程中，存在电池寿命短、易发生感染、不能完全模拟正常心跳顺序等缺点。为弥补上述缺陷，应用基因工程构建生物起搏器的研究便应运而生。位于窦房结及心房区心肌细胞膜上的乙酰胆碱敏感钾通道与心动过缓有关，该通道主要由Kir3.1基因编码，本研究旨在筛选能够抑制Kir3.1的siRNA，应用RNA干扰的方法抑制Kir3.1蛋白的表达，以期为进一步的实验研究提供技术性依据。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性Wistar新生大鼠40只（中国医科大学实验动物中心提供）。高糖DMEM细胞培养基（Hyclone公司），胰蛋白酶（Sigma公司），Trizol和脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000（Invitrogen公司），Real-time PCR试剂盒及PCR扩增引物（北京天根生物有限公司），兔抗鼠Kir3.1多克隆抗体（Santa Cruz公司），辣根酶标记山羊抗兔抗体（北京中山公司），小鼠抗大鼠β-actin抗体（Sigma公司），辣根酶标记兔抗小鼠抗体（北京中山公司），PVDF膜（Millipore公司），siRNA由上海吉玛制药有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染：采用低浓度的胰酶和Ⅱ型胶原酶联合消化，并采取2次差速贴壁法纯化心房肌细胞。在37℃、5%CO2的培养箱中用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养新生SD大鼠心房肌细胞，细胞悬液以2 ml/孔接种于6孔板中，48 h后细胞融合可达到80%左右。委托上海吉马制药技术有限公司设计并合成3对针对Kir3.1基因的小干扰RNA（表1）。分别将3个片段的siRNA溶于DEPC水中，参照LipofectamineTM2000说明书，用Opti-MEM分别稀释siRNA和脂质体，将两者混合后转染入细胞，4～6 h后换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养并于24，48，72 h后检测各指标。实验分为3组，对照组只加脂质体，不加任何siRNA；阴性对照组转染不针对任何靶基因的siRNA；实验组转染靶向Kir3.1基因的siRNA（siRNA∶脂质体=2∶1）。

表1 针对Kir3.1基因设计的3对siRNA序列Tab.1 3 siRNA sequences designed against Kir3.1 gene

1.2.2 Real-time PCR反应检测Kir3.1mRNA：将细胞消化入RNase-Free 1.5 ml离心管中，加入1 ml Trizol，按试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，反应体系共 10 μl，包括缓冲液 2 μl，复合酶 10.5 μl，寡核苷酸 0.5 μl，DEPC 水 7 μl。采用实时定量PCR仪（BIOER公司）扩增Kir3.1cDNA及内参GAPDH，Kir3.1的上游引物为：5′-AAGTGGCGTTGGAACCTCT-3′； 下 游 ：5′-GATGTAGCGGTAGCCATAG-3′。GAPDH上游引物为：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游为：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，反应体系为：cDNA 1.5 μl，上、下游引物各 1.0 μl，PCR mix 10 μl，ddH2O 6.5 μl，按下述条件进行反应：95℃10 min，95℃10 s；58℃20 s，68 ℃ 40 s，35 个循环。并采用 2-△△Ct法计算Kir3.1mRNA的相对含量。

1.2.3 Western blot检测Kir3.1蛋白表达：细胞收集于1.5 ml离心管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，超声破碎细胞，离心后提取蛋白，考马斯亮蓝法测蛋白浓度，蛋白上样量为80 μg，体系为20 μl。配制12%聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、转膜、封闭（5%脱脂牛奶）、一抗4℃孵育过夜（Kir3.1为1∶500稀释、β-actin为1∶1 000稀释），洗膜45 min，加入过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后电化学发光（electrochemiluminescence，ECL），应用 Metamorph图像分析软件分析各组Kir3.1与β-actin的蛋白灰度值，以对照组Kir3.1与β-actin的比值为“1”，其余各实验组均与“1”比较即得到各组蛋白相对含量。

1.3 统计学处理

应用SPSS11.0统计学软件，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小干扰RNA（siRNA）的筛选结果

原代心房肌细胞分别转染3对siRNA 24 h后，Real-time PCR检测发现它们能够抑制Kir3.1mRNA的表达，抑制率分别为（15.7±0.4）%、（24.2±0.2）%和（39.9±0.3）%，与对照组比较，siRNA-2、siRNA-3 组抑制率差异有统计学意义（P<0.05），siRNA-3组抑制率更高，因此选用siRNA-3做后续实验。

2.2 Real-time PCR检测siRNA-3抑制Kir3.1 mRNA时效性

将40 nmol/L Kir3.1-siRNA转染至心房肌细胞，24、48 、72、96 h 抽提其 RNA，逆转录，经定量 PCR检测，与对照组比较发现24 h时Kir3.1mRNA表达量开始下降，为对照组的（56±1）%；48及 72 h时下降更为明显，分别为对照组的（49±3）%及（33±1）%（P<0.05），至 96 h时，为对照组的（88±4）%，抑制效果不显著（P>0.05）。

2.3 Western blot检测siRNA-3对Kir3.1蛋白表达的影响

转染Kir3.1-siRNA 48及72 h后抽提蛋白，经Western blot检测发现，48及72 h后实验组Kir3.1蛋白水平均较对照组明显下降，分别是对照组的（37±3）%和（19±2）%（P<0.01），见图 1。

3 讨论

病态窦房结综合征是心脏窦房结及其邻近组织病变，引起窦性心动过缓和相关心脑供血不足症状［1］。人群发病率高，是威胁人类健康的常见心血管疾病之一，目前以安装电子起搏器治疗为主。随着生物医学工程技术的飞速进展，生物起搏器可能成为电子起搏器治疗病窦的有益补充［2］。近年来，多项研究成果为生物起搏的概念提供了直接证据［3～5］。

图1 转染siRNA后Kir3.1蛋白的相对表达量Fig.1 The expression level of Kir3.1 protein after trasfection

乙酰胆碱敏感性钾通道（muscarinic acetylcholine-sensitive K+channel，KAch）是心房特异性离子通道，它极少分布于心室肌［6］，由Kir 3.1和Kir 3.4共同组成。心脏迷走神经通过释放的乙酰胆碱，作用于心房肌细胞M2A-ChR-G蛋白-IK，Ach通路，激活KAch通道，发挥其对心脏的调节作用，从而减慢心率［7］。Bettahi等［8］研究发现 KAch通道的特性主要与Kir 3.1有关，Kir 3.1可增加KAch通道的活性。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术的主要目的是高效特异性降解目标信使RNA，阻断翻译蛋白质的过程，从而抑制目标基因的表达［9］。本技术抑制Kir 3.1基因实验研究的结果表明：24 h时Kir3.1mRNA表达量开始下降，48及72 h时下降最为明显；Western blot检测发现，48及72 h后实验组Kir3.1蛋白水平均较对照组均明显下降。可见人工合成的siRNA可明显抑制Kir3.1mRNA和蛋白表达。

我们在3个人工合成的siRNA寡核苷酸片段中筛选出抑制效率最高的片段siRNA-3，将其转染至心房肌细胞并检测Kir 3.1蛋白表达情况。为保证siRNA转染效率最高，抑制Kir 3.1基因表达的效果最显著，筛选便成为该研究的关键一步。这里选用Real-time PCR检测3个siRNA片段转染后心房肌细胞Kir3.1基因的表达情况，该方法灵敏度高，且定量精准。

本实验利用RNAi技术成功下调了心肌细胞上Kir 3.1mRNA和蛋白的表达，初步探索了原代心肌细胞的转染方法，并筛选出了基因沉默效果最好siRNA寡核苷酸片段，为下一步体内外实验研究Kir 3.1蛋白变化在病窦发生发展中的意义奠定了实验基础。

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