羟基喜树碱对人前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

金光虎,陈 爽,杨 丽,王光兰,孔祥波*

(1.吉林大学中日联谊医院泌尿外科,吉林长春 130033;2.吉林大学白求恩医学院病理学教研室)

羟基喜树碱对人前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响

金光虎1,陈 爽2,杨 丽2,王光兰2,孔祥波1*

(1.吉林大学中日联谊医院泌尿外科,吉林长春 130033;2.吉林大学白求恩医学院病理学教研室)

目的观察羟基喜树碱(HCPT)对前列腺癌PC-3m细胞凋亡的影响,初步探讨其作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪(FCM)及激光共聚焦显微镜(CLSM)检测细胞增殖与凋亡变化。结果HCPT作用后PC-3m生长明显受抑,且呈时间-浓度依赖性;在FCM及CLSM上可见凋亡率增加。结论HCPT体外能有效抑制前列腺癌细胞株生长;但其作用机制目前尚需进一步研究。

羟基喜树碱;前列腺癌,凋亡;化疗

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0012)

羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin,HCPT)是从我国特有且资源丰富的喜树中提纯的抗癌药,具有广泛的药理学作用。近年来HCPT对于其他肿瘤细胞作用的研究报道日见增多,其体内外的抗肿瘤活性受到极大关注[1]。本实验对HCPT诱导前列腺癌PC-3m细胞凋亡进行研究,以探讨其能否诱导PC-3m细胞凋亡及抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料 前列腺癌细胞株PC-3m由吉林大学基础医学院病理教研室惠赠。HCPT注射液(黄石飞云制药公司)。RPMI-1640培养基(GIBCO公司);小牛血清(天津灏洋公司);MTT及DMSO(北京博奥森公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将PC-3m置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱培养,细胞呈单层贴壁生长后取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞抑制率检测 采用MTT法。取生长良好的PC-3m细胞,调整细胞浓度至(1-2)×104个/ml接种于96孔培养板内,待细胞贴壁后实验组分别加入终浓度为 1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml的HCPT,空白对照组不加药物。每组设3个复孔,放入CO2培养箱内培养12 、24、48 h,然后每孔加 MTT 溶液 20 μ l(5 mg/ml),再培养4 h,弃上清,每孔加入 100 μ l DMSO 振荡 ,使结晶完全溶解,在全自动酶标仪上测定吸光度值(A值),计算不同浓度药物作用后细胞生长抑制率,实验重复3次,取平均值。细胞生长抑制率(%)=(对照组A值-加药组A值)/对照组A值×100%。

1.2.3 细胞凋亡率检测 以不含EDTA的胰酶消化收集经过不同浓度药物处理的PC-3m细胞(1-2)×106,PBS 洗涤两次(1 200 rpm 5 min),加入500 μ l的 binding Buffer悬浮细胞 ,加入5 μ l Annexin V-FITC混匀后再加入 5 μ l PI混匀,室温避光反应 5-10 min,上FCM及CLSM检测细胞凋亡率。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件,结果以±s表示。采用方差分析和 t检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 细胞抑制率 HCPT 1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml各组细胞增殖抑制率分别为 2.56%、5.45%、26.57%、56.07%、87.42%和88.27%。随HCPT作用浓度的增加,细胞增殖逐渐减慢。HCPT对细胞增殖的抑制率随药物浓度的增高而增大,二者呈正相关关系(r=0.761,P＜0.05)。应用IC50计算公式算出给药12 h、24 h、48 h 的 IC50分别为:5.421×10-2、2.371×10-3、7.981×10-4mg/ml,显示 IC50随药物作用时间延长而降低。

2.2 细胞凋亡率及死亡率 图1为流式细胞仪检测结果。阴性对照组 、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml组凋亡率分别为 2.0%、11.8%、18.7%及17.5%。死亡率为4.1%、2.8%、2.3%及6.6%,经过不同浓度药物处理后凋亡率及死亡率呈上升趋势。重复实验显示类似结果。

2.3 CLSM检测细胞凋亡率 在激光共聚焦显微镜下,早期凋亡细胞胞膜呈固缩状的绿色荧光,晚期凋亡细胞胞膜呈固缩状的桔红色荧光,活细胞胞膜结构正常不着色。依据上述标准,镜下计数并计算各组细胞凋亡率。结果表明,1×10-1mg/ml HCPT处理组和对照组处理24 h的PC-3M细胞,各组凋亡率分别为(43.78±0.85)%和(2.24±1.07)%,HCPT组凋亡率与对照组比较,差异均有显著性(P＜0.01)。(见图2)。

图1 苦参碱对细胞凋亡率及死亡率的影响

图2 Annexin V/FITC与PI双染色检测HCPT对PC-3m细胞诱导凋亡作用

3 讨论

HCPT是一种天然抗癌药物,具有广谱抗肿瘤作用。而诱导肿瘤细胞凋亡是许多化疗药物发挥治疗作用的主要机制[2],目前HCPT已知的抗癌途径在于通过嵌合抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ而成为细胞周期特异性的抗癌药[3]。近年来有研究表明,喜树碱类抗癌药的细胞毒作用与其抑制的活性并不一致,提示喜树碱类药物尚有其他抗肿瘤机制[4]。

本研究中利用形态学和细胞生物学方法证实HCPT对PC-3m细胞具有细胞毒作用及可以诱导其凋亡。MTT试验结果表明,HCPT对体外PC-3m细胞的抑制率与作用时间、药物浓度呈正相关;其半数抑制浓度随药物作用时间延长而降低。CLSM观察药物处理后的细胞,形态学表现为染色各不相同、细胞结构相差各异。早期凋亡细胞胞膜呈固缩状的绿色荧光,晚期凋亡细胞胞膜呈固缩状的桔红色荧光,活细胞胞膜结构正常不着色。通过FCM测细胞凋亡率见随着药物浓度增加细胞凋亡率明显增加。

我们通过实验证实HCPT对PC-3m细胞具有细胞毒作用及可以诱导其凋亡,但其疗效尚需通过动物实验及临床实验进一步证实。

[1]Pienta KJ,Coffey DS.A structural analysis of the role of the nuclearMatrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome[J].J Cell sci suppl,1999,1:123.

[2]Gilligan T,Kantoff PW.Chemotherapy for prostate cancer[J].Urology,2002,60(3):94.

[3]Cho YS,Cho-Chung YS.Antisense protein kinaseA RIalpha acts synergisticallywith hydroxycamptothecin to inhibit growth and induce apoptosis in human cancer cells:molecular basis for combinatorial therapy[J].Clin CancerRes,2003,9(3):1171.

[4]Feng LF,Zhong M,Lei XY,et al.Bcl-2 siRNA induced apoptosis and increased sensitivity to 5-fluorouracil and HCPT in HepG2 cells[J].J Drug-Target,2006,14(1):21.

Hydroxycamp to the cininduced human prostate cancer Line PC-3m cell apoptosis

JIN Guang-hu,CHEN Shuang,YANGLi,et al.(Department of Urology,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo study the feasibility of treatment of prostate cancer using HCPT and itsmechanism.MethodsAdd a certain concentration of HCPT in human prostate cancer PC-3m cell incubated together,using the method of MTT、FCM and CLSM to detect the changes in cell proliferation and apoptosis.ResultsHCPT can inhibit the growth of human prostate cancer PC-3m cell obviously,and showing a time-a concentration-dependent;The rate of apoptosis increases in FCM and CLSM.ConclusionHCPT can inhibit the growth of human prostate cancer PC-3m cell in vitro tests.However,the mechanism is yet to be further studied.

hydroxycamptothecin;prostate carcinoma;apoptosis;chemotherapy

R735.7

A

1007-4287(2010)01-0012-02

*通讯作者

2009-03-08)