血小板反应素1与子宫颈病变的相关性

张立杰,李体远,任莉莉

(暨南大学附属二院深圳市人民医院妇科,广东深圳 518020)

血小板反应素1与子宫颈病变的相关性

张立杰,李体远,任莉莉

(暨南大学附属二院深圳市人民医院妇科,广东深圳 518020)

目的检测血小板反应素1(TSP-1)在正常对照、子宫颈上皮内瘤变(CIN)和子宫颈癌(CC)的表达情况,比较不同程度子宫颈病变和正常对照之间TSP-1蛋白表达差异。方法以80例不同程度子宫颈病变患者作为研究组,20例正常宫颈的妇女作为对照组。共收集CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌各20份宫颈病变组织和20例正常宫颈组织。用免疫组化及RT-PCR的方法检测TSP-1的表达情况。结果不同程度子宫颈病变及正常对照中均可检测到TSP-1蛋白的免疫染色。在正常子宫颈和不同程度子宫颈病变中均都可检测到TSP-1 mRNA的表达,其表达的阳性率为100%。从正常对照组到CC组TSP-1的表达强度有逐渐降低的趋势。CINⅠ与对照组之间TSP-1表达强度无明显差异。但CINⅡ、CINⅢ和CC组与CINⅠ和对照组之间,前者的表达强度明显低于后者,有显著性差异(P＜0.05)。结论TSP-1蛋白和mRNA表达随子宫颈病变程度逐渐降低。提示TSP-1的表达抑制内源性血管形成,与子宫颈病变程度相关。

血小板反应素1;子宫预病变;宫颈癌

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0878)

宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是子宫颈癌前病变,分为CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期。由于子宫颈病变的发生要有新生血管提供血液,在肿瘤中新生血管的形成主要发生在肿瘤边缘,可能与局部微环境有关。血小板反应素-1(Thrombospondin-1,TSP-1)是一种内源性血管形成抑制因子,对调控血管形成起重要作用。研究其在子宫颈病变中的表达及其调节,对宫颈病变机制研究发病将有重要意义,并可能从抑制血管形成着手探索治疗子宫颈病变新途径。

1 实验材料

1.1 组织标本

子宫颈病变组按宫颈病变程度:CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌各20份。对照组为行子宫切除手术且排除了子宫颈病变患者,共20份。患者年龄不限,术前未接受过治疗,无其它内分泌、免疫和代谢性疾病。所有病例均经阴道镜活检、子宫颈锥切手术或开腹手术获得。所有标本均在手术切除后半个小时之内处理。研究组年龄为37.7+3.3岁,对照组年龄为34.9+2.6岁,两组相比无统计学显著性差异。

1.2 主要抗体及试剂

鼠抗人TSP-1单克隆抗体(Santa cruz,USA),TRIzol Reagent(GIBCO/BRL,USA)Takara EX Taq DNA Polymerase(宝生物工程(大连)有限公司),cDNA first chain amplification system(Invitrogen,USA)

1.3 实验方法

1.3.1 Western Blot检测子宫颈病变中TSP-1蛋白表达 收集各组样本匀浆,提取总蛋白,用聚乙二醇2000浓缩,SDS-PAGE及转膜,依次以 1∶700稀释的单克隆TSP-1抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体孵育,化学发光法检测。

1.3.2 RT-PCR检测TSP-1 mRNA在子宫颈病变中的表达 细胞总RNA的提取按照TRIzol产品说明完成。RNA稀释成100 ng/ul左右。mRNA逆转录成cDNA分子按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明完成。TSP-1及β-actin扩增方案为 :反应体积 25 μ l。10×PCRBuffer(无MgCl2)2.5 μ l,2 mMdNTP 2.5 μ l,2 mM MgCl21.5 μ l,2.5 μ M βactin 引物 2 μ l,5.0 μ M 的 TSP-1 引物 2.0 μ l,Taq(5 μ/ul)0.5 μ l,cDNA 2 μ l,用去离子水补足至 25 μ l。进行PCR扩增。

1.4 统计学分析

本实验采用SPSS软件分析,TSP-1的定量结果的比较用t检验,P＜0.05认为有意义。

2 结果

2.1 TSP-1蛋白在子宫颈病变中的表达

Western blot检测结果表明,不同程度子宫颈病变及正常对照中均可检测到TSP-1蛋白的免疫染色(见图1)。正常对照中为TSP-1强阳性,但子宫颈病变TSP-1的表达多为弱阳性,并随病变程度染色强度减弱,在CINⅢ、CC的TSP-1染色与正常对照相比,差异有显著性(P＜0.05)。

图1 TSP-1的Western blot结果

2.2 RT-PCR扩增TSP-1mRNA

根据所选引物,TSP-1的扩增产物为492 bp的片断。内参对照物β-actin的扩增产物长度为326 bp。

2.3 TSP-1 mRNA的表达情况

RT-PCR半定量的结果表明,在正常子宫颈和不同程度子宫颈病变中均都可检测到TSP-1 mRNA的表达(表1)。CINⅠ与对照组之间TSP-1表达强度无明显差异。但CINⅡ、CINⅢ和CC组与CINⅠ和对照组之间,前者的表达强度明显低于后者,有显著性差异(P＜0.05)。

图2 TSP-1扩增结果

表1 TSP-1mRNA在子宫颈病变中的表达

3 讨论

血管形成肿瘤的发生、进展和转移中起重要作用,尽管大量流行病学研究证实,现已明确人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌和CIN的发病的根本治病因素[1],但子宫颈病变的发生发展必须要有新生血管提供血液,故血管形成在子宫颈病变的发病中具有重要作用。在血管形成的过程中,血管内皮生长因子(VEGF)等有血管形成活性的分子固然重要,但在大多数情况下,血管形成活性分子与抑制血管形成分子之间的平衡才是决定血管主要因素[2],因此近年对血管形成抑制分子的研究也逐渐增多,其中血小板反应素(TSP-1)倍受关注。TSP-1是一种分子量为450 KD三聚体细胞外基质糖蛋白,多种正常细胞和肿瘤细胞均可分泌TSP-1,目前认为它是一种内源性的血管形成抑制分子,体外和体内实验均表明它可抑制血管内皮细胞的增殖及肿瘤血管形成[3,4]。

宫颈癌是常见的妇科肿瘤,严重地威胁着女性的生命健康。子宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是子宫颈癌前病变,CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ发展为癌的危险分别是 15%、30%和45%。本研究从蛋白和核酸水平比较了不同程度子宫颈病变之间TSP-1的表达情况,结果发现,从正常组织→CINⅠ→CINⅡ→CINⅢ→子宫颈癌均有TSP-1不同程度的表达。从正常对照组到宫颈癌TSP-1的表达强度有逐渐降低的趋势。CINⅠ与对照组之间TSP-1表达强度无明显差异。但CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌与CINⅠ和对照组之间,前者的表达强度明显低于后者,有显著性差异(P＜0.05)。上述结果与TSP-1作为内源性血管形成抑制分子的作用是一致的,说明血管形成刺激因子和抑制因子之间的动态平衡是决定血管形成的关键。

通过对不同程度子宫颈病变中的TSP-1mRNA的检测,说明血管与抗血管形成在肿瘤治疗中的潜在应用价值[5-7]。如能将其成功应用在子宫颈病变的治疗中,无疑为其增加了一种有效的辅助治疗方法。研究表明TSP-1在子宫颈病变的血管形成中有重要作用,因此可利用其作为治疗的切入点。随国内外研究的深入,可能从抑制血管形成着手探索新的治疗子宫颈病变的方法。

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Correlation of angiogenesis inhibitor molecules TSP-1 with cervical lesion

ZHANGLi-jie,LI Ti-yuan,REN Li-li.(Department of Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Jinan Unive rs ity and Shenzhen Municipal People's Hospital,Guangdong Shenzhen518020,China)

ObjectiveTo investigate the expression TSP-1 protein and vessel density normal cervix、cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.MethodsWestern Blot and RT-PCR to detect TSP-1 expression in 80 patients who had undergone cervix biopsy,conization,and radical total hysterectomy were selected as study group,and further subdividing this group into 4 groups,20 specimens of each according to the histological grade of cervical lesion(CINⅠ-Ⅲ,cervical cancer,CC).ResultsThe results showed that there are no difference of expression rates between study group and control group,but there were significant decreases in the expressionof TSP-1mRNA.The density of TSP-1 mRNA waslower than that of the control(P＜0.05).ConclusionThe signifi-cant decrease of TSP-1 proteinand mRNA from CINⅠto CINⅢto CC showed that TSP-1 expressionwas related to the level of angeogenesis and histological grade,which suggests the role of TSP-1 as an endogenous inhibitor of angeogenesis.

TSP-1;Cervical intraepitheliae neoplasia;Cervical Camcer

R737.33

A

1007-4287(2010)06-0878-03

本文课题受广东省深圳市科技技术计划项目基金资助(200702057)

*通讯作者

2009-05-10)