LIFR在原发不孕症患者子宫内膜的表达

张松灵,李春红,魏振彤,田海涵

(1.吉林大学第一医院 妇产科,吉林长春 130021;2.通辽市红星医院妇产科,内蒙古通辽 028007)

LIFR在原发不孕症患者子宫内膜的表达

张松灵1,李春红1,魏振彤1,田海涵2

(1.吉林大学第一医院 妇产科,吉林长春 130021;2.通辽市红星医院妇产科,内蒙古通辽 028007)

目的探讨白血病抑制因子受体(Leukaemia inhibitory factor receptor,LIFR)在子宫内膜的表达,与原因不明原发不孕症的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测30例研究组(原因不明原发不孕症患者)和20例对照组患者分泌中期子宫内膜LIFRmRNA的表达。结果研究组分泌中期子宫内膜LIFRmR NA表达水平为0.640 1±0.234 9,对照组为 1.558 7±0.296 1,研究组较对照组明显降低,差异有极显著性(P＜0.001)。结论LIFR表达减少或缺失,可能与原因不明原发不孕症有关。

子宫内膜;白血病抑制因子受体;卵植入;不孕症

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0881)

白血病抑制因子受体(Leukaemia inhibitory factor receptor,LIFR)是LIF的低亲和性受体,LIF需与受体结合后方可产生生物活性。但是关于LIFR与着床的关系目前尚无明确报道,它与原因不明原发不孕症的关系亦不可知。本实验旨在研究LIFR在原因不明原发不孕症妇女子宫内膜的表达情况,以探究LIFR与原因不明原发不孕症患者着床失败之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料来源

研究组(原因不明原发不孕症患者组)30例,均为2006年5月至2008年09月在吉林大学第一医院及吉林大学中日联谊医院就诊的患者。不孕时间2-7年,年龄22-36岁,平均年龄29岁,月经规律,无痛经,月经周期26-35 d,平均月经周期32天,基础体温双相(高相期14 d),性激素6项水平均在正常范围内,妇科B型超声检查盆腔的子宫及附件正常。输卵管通畅试验证实输卵管通畅。丈夫精液检查正常,双方抗精子抗体阴性。B超监测见成熟卵泡突然消失或缩小,抽血检测E2＞1 100 pmol/L,血LH 34-78 IU/L,即确定该日为排卵日。于排卵日后8-10 d即分泌中期行诊断性刮宫,刮出的子宫内膜一份立即放入-70℃冰箱中保存,另一份子宫内膜行病理检查,证实呈分泌期改变。对照组20例,均为正常受试者,年龄26-38岁,平均年龄32岁,已有生育史,月经规律,无痛经,月经周期26-35 d,平均月经周期30天,基础体温双相(高相期14 d),性激素6项水平在正常范围,B超监测见成熟卵泡突然消失或缩小,抽血检测E2＞1 100 pmol/L,血LH 34-78 IU/L,即确定该日为排卵日。于排卵日后8-10 d即分泌中期行诊断性刮宫,刮出内膜一份立即放入-70℃冰箱中保存,另一份内膜行病理检查,证实呈分泌期改变。两组患者3个月内均未服用可引起性激素变化的药物。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA的提取与鉴定:每例患者取50 mg内膜组织,采用动物总RNA提取试剂盒抽提RNA(试剂盒购自北京鼎国生物公司)。提取的RNA样品在波长260 nm和280 nm处的吸光度(A)比值(A260/A280)保持在1.772-1.985之间,符合蛋白污染容许容量(1.7-2.0),根据A值计算出总RNA浓度。

1.2.2 LIFR引物 cDNA 序列[1],上游:5′-CAAAAGAGTGTCTGTGAG-3′, 下 游:5′-CCATGTATTTACATTGGC-3′,扩增片段长度为459 bp。由于 β-肌动蛋白(β-actin)在所有组织中均呈高水平恒定表达,选其作为内对照,扩增片段长度为300 bp。

1.2.3 LIFRmRNA表达的测定:采用一步法RT-PCR技术检测LIFRmRNA的表达(北京鼎国试剂盒),进行35个循环的PCR扩增:94℃变性1 min,58℃退火1 min,72℃延长2 min。最后72℃延长10 min。

1.2.4 PCR产物测定:PCR反应产物8 μ l加溴芬蓝4 μ l在 2%琼脂糖凝胶中电泳 20 min(100 V),紫外观测仪下摄影,凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值,计算LIFR与β-actin灰度值的比值,即为子宫内膜LIFRmRNA表达水平。

1.3 统计学方法 结果采用t检验。

2 结果

研究组30例原发不孕症患者分泌期中期子宫内膜LIFRmRNA表达水平为1.558 7±0.296 1(图1),对照组20例分泌期中期子宫内膜LIFRmRNA表达水平为0.640 1±0.234 9(图2),均以β-actin灰度值为参照,t=11.63,研究组较对照组分泌期中期子宫内膜LIFRmRNA表达水平明显降低,差异有显著性(P＜0.001)。两组患者平均年龄对照组稍高,平均月经周期研究组稍长,但差异无显著性(P＞0.05)。

图1 研究组LIFRmRNA

图2 对照组LIFRmRNA

3 讨论

LIF调节着床的直接证据,来源于LIF基因突变小鼠[2],利用同源重组法获得LIF缺陷的纯合子小鼠,雌鼠能产生成活胚泡,但不能着床并进一步发育。当将这些胚胎移植到野生型小鼠子宫后,则可正常着床并发育成熟。而部分原因不明原发不孕症患者均出现受精卵着床失败,因此人们联想到LIF与原因不明原发不孕症的关系。LIFmRNA的转录和蛋白翻译,主要在子宫内膜腺上皮细胞中完成,然后合成的蛋白分泌到子宫腔中发挥作用[3,4],采用免疫染色法检测到LIF在子宫内膜腔腺上皮中均表达。而且随月经周期其表达量也出现波动,高峰出现在黄体中晚期即“种植窗”时期,在妊娠早期人子宫内膜及蜕膜中表达量仍较高。从正常可孕妇女子宫冲洗液中可获得大量的LIF表达,而且于月经周期分泌中晚期表达增高。

然而近年来研究表明:LIF在原因不明原发不孕症患者子宫内膜内的表达,较正常人减弱甚至缺失,证明LIF是妊娠助孕因子,它表达的缺失可能与不孕症的发病有关[5,6]。LIFR是LIF受体复合物中的低亲和性受体,系由LIFRα及LIFRβ两条链构成。另外,LIF还有一个高亲和性受体gp130。研究证明,LIF需先以较低亲和力与受体LIFR结合,然后与gp130相互作用形成亲和力高的复合物从而发挥一系列的生物活性。LIFR主要分布于子宫内膜上皮[7],与LIF一样在整个月经周期内均表达,与围着床期升高。但对于LIFR在不孕症妇女子宫内膜内的表达情况国内外却未见报道。

本实验用RT-PCR技术检测原因不明原发不孕症妇女子宫内膜分泌中期LIFR的表达,我们发现原因不明原发不孕症患者子宫内膜分泌中期LIFR的表达与正常对照组相比明显下降甚至缺失,差异有显著性。虽然究竟是什么原因使LIFR的表达减弱或缺失尚不得知,但是实验结果提示我们不孕症患者子宫内膜内LIF及其受体LIFR的表达均减少。那么究竟是LIF分泌减少导致不孕,还是LIFR的减少导致与之结合的LIF减少,从而影响了LIF的生物效应,还有待我们进一步的研究证实。但目前的研究表明LIFR作为LIF的低亲和性受体,作为信号因子与受精卵相呼应,进而使LIF与之结合,协助着床。LIF需先以较低亲和力与受体LIFR结合,然后与gp130相互作用形成亲和力高的复合物,二聚体形成后gp130磷酸化,激活Janus酶,磷酸化下游的信号传导子及转录激活子stat蛋白,从而进入核内激活下游转录因子,产生一系列生物效应。gp130的stat结合位点基因敲除小鼠发生着床失败,证明gp130可激活stat[8],是调节着床的重要环节[9]。而研究表明,LIF不能与gp130直接结合,因此LIFR是LIF发挥其生物活性的重要枢纽。本研究的结果提示我们,作为与受精卵相呼应的信号因子——LIF的低亲和性受体LIFR的表达下降或缺失,可能是导致原因不明原发不孕症妇女子宫内膜分泌中期LIF的表达与正常对照组相比明显下降甚至缺失的主要原因。换句话说:患者子宫内膜分泌中期LIFR的表达下降或缺失可能是原因不明原发不孕症的发病原因。

但是,究竟是什么原因导致LIFR的表达出现这种变化尚不可知,我们将在继续的研究中从基因角度进行分析,找到LIFR的表达下降的深层次原因。从而为原因不明原发不孕症的诊断与治疗提供帮助,也可为新型避孕措施的研制提供新的思路。

[1]Hsin-Fu Chen,Jin-yuh Shew,Hong,Nemg Ho et al.Expression of LIF and its receptor in preimplantation embryos[J].Fertil Steril,1999 Oct,72(4):713.

[2]Stewart CL,Kaspar P,Brunet LJ.Blastocyst implantation depends on maternal expression of LIF[J].Nature,1992,359:76.

[3]Aghajanova L.Leukemia inhibitory factor and human embryo implantation[J].Ann N Y Acad Sci,2004,Dec,1034:176.

[4]Mateusz M,Jana S,Krzysztof S,et al.The assessment of LIF in uterine flushing-a possible new diagnostic tool in states of impaired fertility[J].Reprod Biol,2003,3(3),259.

[5]张松灵,张晓霞,杨玉兰.白血病抑制因子在原发不孕症患者子宫内膜的表达[J].吉林大学学报(医学版),2003,29(5):643.

[6]Kralickova M,Sima R,Vanecek T,et al.LIF gene mutation in the population of infertile women are not restricted to nulligravid patients[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2006,127(2):231.

[7]T Lei,ZQ Yang,T Xia,et al.Stage-specific expression of LIF and its receptor in rabbit pre-implantation embryo and uterine epithelium during early pregnancy[J].Reprod Dom Anim,2004,39,13.

[8]Ernst M,Inglese M,Waring P.Defective gp130-mediated signal transducer and activator of transcription(STAT)signaling results in degenerative joint disease,gastrointestinal ulceration,and failure of uterine implantation[J].J ExpMed,2001 Jul 194(2):189.

[9]K.Wanggren,P.G.Lalitkumar,F.Hambiliki.Leukaemia inhibitory factor receptor and gp130 in the human Fallopian tube and endometrium before and after mifepristone treatment and in the human preimplantation embryo[J].MolecularHuman Reproduction,2007,13(6):391.

Expresstion of leukaemia inhibitory factor's receptor in endometrial of the patients with unexplained infertility

ZHANG Song-ling1,LI Chun-hong,WEI Zhen-tong,et al.(Dept.of Obstetrics and Gynecology,The First Hospital,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the expression of endometrialleukaemia inhibitory factor's receptor(LIFR)in patientswith unexplained infertility.MethodsBy a quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),we detected the expression of LIFR in endometrium during mid-luteal phase in 30 cases infertility group(unexplained infertility)and 20 cases control group.ResultsThe level of LIFRmRNA expressionon endometrium during mid-luteal phase in infertility groupwas,significantly lower than those in the control group.ConclusionThe decreased expression of LIFR might be one of the major causes of unexplained infertility.

Endomertium;LIFR;Ovumimplantation;Infertility

Q816

A

1007-4287(2010)06-0881-03

吉林省科技厅科技发展计划白求恩基金资助项目(合同编号200705155)

*通讯作者

张松灵(1975-),女,吉林省长春市人,主治医师,医学博士,现主要从事助孕技术与肿瘤干细胞的研究工作。

2009-05-09)