副溶血弧菌中具有Mg2+转运功能的MgtE基因的分子克隆与功能鉴定

李来梅 ，于 峰 ，2 ，靳 磊

（1.湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410009；2.湖南师范大学生命科学学院，湖南 长沙 410081）

Mg2+具有独特的几何特性和化学特性，研究人员推测其转运系统也具有独特性[1]。目前，整个生物界中已发现有五大Mg2+转运家族:CorA家族，Mg2+/H+交换体，离子通道，P型磷酸酶和MgtE基因家族[2]。主要的Mg2+转运家族是细菌中的CorA家族，蛋白拓扑分析显示其具有独特结构：N端有一个酸性的周质区，C端有2个疏水的跨膜区，有很强的螺旋性。CorA序列上存在保守基序GMN，是其转运Mg2+所必需的，若GMN基序中有一个氨基酸突变，其转运能力就会丧失[3]。

MgtE基因家族首先在Bacillus firmus OF4中被Ronald等人在寻找新的CorA基因时发现。目前一般认为其具有五个跨膜区。其跨膜区的分布和CorA具相似性，都主要分布于C端，其N端位于胞质区。MgtE和CorA两基因家族在转运离子的类别上也具有部分相似性。MgtE的突变株和CorA一样可增强对Co2+的抗性。MgtE可功能互补缺失CorA，MgtA，MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株MM281，使其可在低浓度 Mg2+浓度（<10 mM）下生长。同时MgtE 也具有Co2+，Cd2+，Mn2+等二价金属离子的转运能力。多序列比对表明其第二和第五个跨膜区较保守。基因组序列搜索显示MgtE家族在古细菌，原核生物和真核生物中都有分布，但其分布的广泛性不如CorA家族。目前对MgtE基因家族转运Mg2+的分子机制还了解甚少。为了更进一步了解MgtE基因家族转运Mg2+的分子机制，笔者从副溶血弧菌中克隆了其MgtE基因，将之称为VP-MgtE，并对其进行了功能鉴定和定点突变等实验。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 E.coli DH5α 在37℃，LB培养基中生长，必要时添加相应抗生素。副溶血弧菌于37℃，LB中培养。S.typhimurium MM281需要高浓度Mg2+才可以生长，它被用于功能互补实验，于37℃，Mg2+（以MgSO4的形式添加）终浓度为100 mM，氯霉素浓度为34μg/mL的LB或N-minimal培养基中生长。

1.1.2 试 剂 2pMD18-T载体和所有酶类均购自大连宝生物工程有限公司。质粒纯化及胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司。pTrc-99A由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 VP-MgtE基因的克隆及载体构建 VP基因组DNA按照Flamm[4]的方法提取。根据VP-MgtE基因序列用Primer Premier5.0设计一对引物，并添加酶切位点SacⅠ和KpnⅠ。正向引物为［TATGAGCTCGAACGAATGGCAG（SacⅠ）］反向引物为［ATAGGTACCACTGGCTTAGATCAGC（KpnⅠ）］。用高保真酶Pyrobest DNA polymerase进行PCR扩增。回收目的片段，连接到pMD18-T载体上，再用SacⅠ和KpnⅠ酶切，定向克隆至表达载体pTrc99A，并酶切鉴定阳性克隆。

1.2.2 生物信息学分析的主要软件及数据库 基因序列数据由NCBI中获得。跨膜区分析软件为TMHMM，多序列比对软件为ClustalW，常规的核酸蛋白分析软件利用DNAMAN进行。

1.2.3 MM281的功能互补和铝离子毒害实验 将pTrc99A-VP-MgtE质粒电击转化进入MM281。鉴定阳性克隆，分别挑取MM281-VP-MgtE，MM281-pTrc，MM281单菌落在试管中过夜培养。然后再按50∶1（LB∶菌液＝50 mL∶1 m）的比例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养。同时测值。当达到0.6～0.7之间时，加入1mM/L的IPTG进行诱导，当到达1.0时取出，取菌液100μL加入 900 μL 水中。分别稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。取稀释的菌液2μL点样于不同Mg2+浓度的互补平板上，Al3+（以AlCl3的形式添加）毒害中点样于pH 5，Mg2+浓度为100 mM的LB固体培养基上。37℃倒置培养2 d后观察菌落生长情况并拍照。

1.2.4 液体生长曲线 挑取MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-pTrc的单菌落在含相应抗生素的LB中摇菌，当OD600=0.6～0.8时，1 200 rpm离心收集细胞，用去离子水清洗两遍，以除去残留的Mg2+，然后用去离子悬浮。准备7种不同浓度（0μM，50μM，100μM，500μM，1 mM，5 mM，10 mM）和相应抗生素的N-minimal培养基，将上述准备好的培养物（起始=0.001～0.002）加入N-minimal培养基中。37℃摇菌，每2 h测一次并记录数据。共测24 h。

1.2.5 离子敏感性实验 按功能互补实验过程一样准备好菌液，然后点至不同浓度的金属离子板上。37℃倒置培养2 d后观察其生长情况并拍照。

1.2.6 定点突变 定点突变的方法按照分子克隆上介绍的重叠延伸诱变的方法分别设计两对引物。从野生型VP-MgtE-pTrc99A中用高保真酶Pyrobest DNA polymerase进行三次PCR。再SacⅠ，KpnⅠ双酶切，定向构建至pTrc-99A上产生特异位点的突变。突变引物设计见表1。再按照1.2.3的方法进行功能互补实验。

表1 突变引物设计表

2 结果与讨论

2.1 VP-MgtE与MgtE基因家族其它成员相比显示部分序列相似性

VP-MgtE的编码一个含451个氨基酸的蛋白质。跨膜分析显示其具有五个跨膜区。其与Bacillus firmus OF4和Providencia stuartii中的MgtE序列分别具有21.15%，14.69%的相似性。多序列比对表明它们在第二和第五个跨膜区具有较高的相似性（见图1）。

图1 VP－MgtE与MgtE家族其他基因clustalw比对图

图1 为VP-MgtE和MgtE家族其他成员运用ClustalW的比对结果。TM2，TM5方框标示处的A、G、D、G位点表示突变后对其功能影响很大者，TM4，TM5方框标示处的D、L位点表示对其功能影响较少者，TM4方框标示处的P位点表示无影响。图中标出的五个跨膜区（TM1-TM5）为根据VPMgtE的蛋白拓扑结构预测所得到。比对中其他基因 GenBank登陆号分别为 B.firmus：U18744；P.stuartii：U23806；Human；NM_173854。

2.2 VP-MgtE可功能互补MM281的生长

MM281是一类丧失了 CorA，MgtA，MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株。它只能在高浓度Mg2+（>100 mM）下达到最佳生长速度。结合功能互补的方法，它可作为一个研究Mg2+转运的很好的系统。表达了VP-MgtE的MM281重组菌株可在低浓度Mg2+情况下生长，甚至在不加Mg2+的LB培养基上生长。而其阴性对照MM281，pTrc99A-MM281则只能在大于10 mM的N-minimal培养基上生长（见图2）。结果说明，VP-MgtE的表达互补了MM281在Mg2+转运上的功能缺失，使之重新具有了Mg2+转运能力。从而使其可在含低浓度（<10mM）Mg2+的培养基中生长。生长曲线结果也再次证明了目的基因的转运能力。由图3、图4可知，表达了目的基因的MM281转化子可在 100μM的N-minimal培养基中生长。而阴性对照只能在10 mM的培养基中生长。

图2 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在不同Mg2+浓度的N-minimal互补平板上的生长结果

图3 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 10 mM Mg2+的N-minimal培养基中的生长结果

图4 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 100 μM Mg2+的N-minimal培养基中的生长结果现差别

2.3 VP-MgtE的表达改变了MM281的离子敏感性

已有研究显示，当细菌中积累一定量的重金属离子（如 Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+）时，就会对细菌本身产生毒害作用并使之死亡。由图5可知，表达了VP-MgtE基因的转化子增加了对Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+的敏感性，当 Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+离子浓度分别达到500μM，500μM，500μM，1 mM 时，表达了目的基因的菌株就会死亡。可以认为VP-MgtE有Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+，Ni2+，Fe2+，Cu2+离子的转运能力。

2.4 VP-MgtE的表达提高了MM281对铝毒害的抗性

研究表明当pH<6时铝离子就可从结合态释放出来产生毒害作用。在pH=5时研究了VP-MgtE的铝抗性，结果表明VP-MgtE的表达可提高MM281对铝毒害的抗性（见图6）。为了证实确实是Al3+而不是Cl-在起毒害作用，同时做了KCl的实验，与对照相比，实验数据没有区别。

2.5 定点突变改变了VP-MgtE的Mg2+转运能力

图5 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含有不同金属离子浓度的N-minimal固体培养基上的生长结果

图6 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含不同铝离子浓度的LB平板上的互补结果

运用定点突变的方法对VP-MgtE蛋白中的7个氨基酸进行了突变，由图7可以发现，VP-J1，VP-J2，VP-J5，VP-J6 的突变使目的蛋白的 Mg2+转运能力有很大的降底，VP-J4的转运能力和目的蛋白相比，有轻微的降底，VP-J3，VP-J7出乎实验预期，在10μM情况下和目的蛋白相比这两个突变株的转运能力明显提高。这些突变都集中在第2和第5跨膜区。在这两个跨膜区的每个突变对其转运能力都有影响，这也说明了这两个跨膜区在Mg2+装运中的重要性。

图7 定点突变结果

3 讨论

序列分析显示VP-MgtE的蛋白序列与目前已知的MgtE家族成员显示了部分相似性，多序列比对表明，它们在第2和第5个跨膜区和其它成员有较高的相似性。在一些特定的保守基序中MgtE家族成员具有完全的相似性，如第5个跨膜区的DP基序。实验运用定点突变的方法研究了这些保守区域，结果显示，当这两个跨膜区中的一些保守氨基酸突变以后，它的镁离子转运能力和野生型相比有明显下降，甚至是完全丧失。同时本课题组还从不同的菌种克隆了3个MgtE家族成员并进行了功能鉴定，它们在这些保守的基序中也是完全一致的。由此可见，这些保守的氨基酸是MgtE家族发挥Mg2+转运功能所必需的。

此外，实验结果还表明VP-MgtE转运Mg2+不受pH值的影响。同时在实验中还发现VP-MgtE在高浓度的Mg2+下的生长反而不如在低浓度的情况下生长的快，因此猜测VP-MgtE可能为一类高亲和性，转运镁离子的载体蛋白。

[1]Gibson M M，Bagga，Maguire M E.Magnesium transport in Salmo nella yphimurium:The influence of new mutation conferring Co2+resistance on the CorA Mg2+transporter system[J].Mol.Microbiol，1991，（5）：2753－2762.

[2]Richard CG.Genes for magnesium transport[J].Current Opinion，2003，（6）：263-267.

[3]Li L，Ana F T，Revel S M，et al.A Novel Family of Magnesium Transport Genes in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2001，（13）：2761-2775.

[4]Flamm R K，Hinrichs D J，Thomashow M F.Introduction of pAM beta 1 into Listeria monocytogenes by conjugation and homology between native L[J].monocytogenes plasmids，1984，44：157-161.