阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖凋亡的影响

蒋凌志，张庆光，钟 华

(广州医学院荔湾医院ICU，广东 广州 510170)

阿托伐他汀是当前最强效的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，广泛用于降脂，能诱导兔髂动脉平滑肌细胞凋亡[1]。本课题前期研究发现阿托伐他汀可以减轻低氧大鼠肺动脉高压、改善肺血管重塑[2]。由于肺动脉管壁主要由平滑肌构成，本研究利用常压低氧舱复制低氧肺动脉高压大鼠模型，观察阿托伐他汀对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 低氧大鼠模型复制及实验分组 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠40只，体重(180±20)g(广东省动物实验中心提供，合格证号2007A003)。随机分为4组：对照组(Control，C)、低氧组(Hypoxia，H)、干预组Ⅰ、干预组Ⅱ，每组10只。干预组Ⅰ、Ⅱ组每天低氧前30 min分别灌胃给予阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司进口分装，批号85837007)1.5 mg/kg和3.0 mg/kg，对照组(C)和低氧组(H)给予生理盐水0.5 ml。除对照组外，其他组置于常压低氧箱内，箱内氧浓度稳定于（10±0.5）%，每天低氧8 h，每周6 d，连续4周。

1.2 肺组织标本的取材和制备 实验结束时打开大鼠胸腔，取一侧肺叶以10%甲醛缓冲液固定，梯度酒精顺序脱水，二甲苯透明后石蜡包埋切片(厚5μm)，用于免疫组织化学分析和原位缺口末端标记法(TUNEL)研究。

1.3 增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学检测 所有组织标本均在同一条件下进行免疫组织化学染色，一抗为小鼠抗大鼠PCNA抗体(武汉博士德，批号20080801)，二抗为羊抗小鼠免疫组化试剂盒(武汉博士德，批号200811)。PCNA阳性染色呈棕黄色细颗粒状，主要位于细胞核。每只大鼠取一张切片，高倍镜下观察10条血管外径约为100μm的肺小动脉，计数平滑肌细胞总数及PCNA阳性细胞数目，计算PCNA阳性细胞所占百分比，即增殖指数(PI)。

1.4 TUNEL应用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞 操作按细胞凋亡检测试剂盒(Roche Diagnotics GmbH，14492200)说明书进行，细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性，即凋亡细胞。每只大鼠测量10条血管外径约为100μm的肺小动脉，计算平滑肌细胞凋亡数目与细胞总数比值，即凋亡指数(AI)。

1.5 统计学处理 用SPSS11.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间总体差异比较采用单因素方差分析，两组间差异比较采用q检验，检验水准为а=0.05。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响 各组均可见增殖的PASMC细胞。低氧组PASMCs的PI较对照组显著增高（P＜0.01）；干预组Ⅰ、ⅡPASMCs的PI与低氧组比较明显下降，差异均具有统计学意义（P＜0.01），提示阿托伐他汀对低氧大鼠PASMCs增殖有抑制作用，但两干预组之间比较，差异无统计学意义，见表1。

2.2 阿托伐他汀对大鼠PASMCs凋亡的影响 各组均可见凋亡的PASMCs细胞。低氧组大鼠PASMCs的AI与对照组比较显著下降（P＜0.05）。干预组Ⅰ、Ⅱ大鼠PASMCs的AI与低氧组比较显著增高（P＜0.05），提示阿托伐他汀对低氧大鼠PASMCs凋亡有促进作用，但两组之间比较，差异无统计学意义，见表1。

表1 阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌增殖与凋亡的影响（±s）

表1 阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌增殖与凋亡的影响（±s）

注：与对照组比较,*P＜0.01；与低氧组比较,△P＜0.05。

组别 例数 增殖指数PI(%)凋亡指数AI(%)对照组低氧组干预组Ⅰ干预组Ⅱ101010104.5±0.528.0±2.4*17.0±2.9△14.0±1.3△4.1±0.43.0±0.3*9.20±2.71△11.5±3.79△

3 讨论

近年发现他汀类药物对低氧肺动脉高压有治疗作用[3-5]，本课题前期研究也证实阿托伐他汀可以减轻低氧大鼠肺动脉高压、改善肺血管重塑[2]。肺血管重塑的机制是细胞增殖与凋亡的平衡破坏，慢性缺氧时肺动脉壁细胞增殖加强而凋亡减少[6]。

实验结果显示各组大鼠肺组织切片中PASMCs细胞增殖和凋亡状态并存。对照组增殖与凋亡基本平衡；低氧组大鼠PASMCs增殖显著增加、凋亡显著下降，因而出现显著的肺血管重塑；与低氧组比较，两干预组大鼠PASMCs增殖显著降低、凋亡增加，但增殖仍超过凋亡，故肺血管仍有重塑现象，程度有所减轻。干预组PASMCs的AI与对照组比较有增加的趋势，与文献报道[7-8]一致。说明阿托伐他汀对低氧大鼠PASMCs存在双重影响：既可以抑制其增殖，又可以促进其凋亡，并通过这两方面作用达到抑制肺血管重塑的效果。而两干预组(1.5 mg/kg或3.0 mg/kg阿托伐他汀灌胃)之间比较，不论是PI还是AI均无明显差异，提示阿托伐他汀抑制PASMCs增殖，促进PASMCs凋亡的作用可能不存在剂量依赖。

有研究证实阿托伐他汀影响细胞增殖及凋亡与信号传导与转录激活因子（Stat3）通路密切相关，Stat3磷酸化活性调节其下游靶基因的表达[9]，因此，阿托伐他汀对Stat3下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2的影响将在我们今后的实验中进一步深入研究。

[1]陈 斌,邓玉莲,吴志勇,等.阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化模型血管壁平滑肌细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2004,24(6):542-544.

[2]蒋凌志,张庆光,钟 华.阿托伐他汀预防低氧性肺动脉高压的实验研究[J].实用医学杂志,2009,25(24):4014-4136.

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[5]张郁青,张秀伟,朱 颖,等.阿托伐他汀对慢性阻塞性肺疾病合并肺动脉高压患者的影响[J].心肺血管病杂志,2009,28(4):250-253.

[6]陶清国,张珍祥,徐永健.慢性缺氧大鼠肺内(肺血管壁)细胞增殖、凋亡及c-myc、P53基因表达研究[J].中国应用生理学杂志,1999,15(2):169-172.

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[9]唐 梅,张 钲,宁金民,等.JAKZ/STAT3信号通路在阿托伐他汀抗大鼠血管平滑肌细胞增殖凋亡中的作用研究[J].中国分子心脏病学,2006,6(3):161-165.