灰树花多糖脂质体的制备方法研究

耿传信，杨海，刘雪丽（1.山东青岛市肿瘤医院药剂科，青岛市 6604；.山东青岛市中心医院药剂科，青岛市 6604）

灰树花多糖脂质体的制备方法研究

耿传信1＊，杨海2，刘雪丽2（1.山东青岛市肿瘤医院药剂科，青岛市 266042；2.山东青岛市中心医院药剂科，青岛市 266042）

目的：制备灰树花多糖脂质体。方法：用反向蒸发法、乙醚注入法、乙醇注入法、薄膜分散法制备灰树花多糖脂质体，根据包封率的高低确定制备方法；用葡聚糖凝胶层析法对灰树花多糖脂质体进行分离，硫酸-苯酚比色法测定游离灰树花多糖含量，负染色法观察其形态。结果：反向蒸发法、乙醚注入法、乙醇注入法、薄膜分散法制备灰树花多糖脂质体的包封率分别为20.15%、16.32%、10.26%、7.99%，形态为圆形或椭圆形，平均粒径为200 nm。结论：采用反向蒸发法制备的灰树花多糖脂质体包封率较高，是多糖类药物制备脂质体较好的方法；葡聚糖凝胶层析法对灰树花多糖脂质体的分离效果较好。

灰树花多糖；脂质体；制备；反向蒸发法；葡聚糖凝胶层析法

脂质体是近年来研究较多的一种被动靶向制剂，由于具有靶向性、缓释性、细胞组织相容性及延长药物作用时间等特点，其应用受到重视[1，2]。灰树花多糖是灰树花发酵菌丝体中经热碱提取的灰树花倍他葡聚糖（Polysaccharides ofGrifola frondosa）[3]，临床上拟用于恶性肿瘤和免疫缺陷症的辅助治疗。由于灰树花多糖属多糖类药物，口服吸收较差，做成脂质体后有望提高其口服生物利用度。笔者应用了反向蒸发法、乙醇注入法、乙醚注入法、薄膜分散法[4]等几种方法制备灰树花多糖脂质体，并就灰树花多糖脂质体的分离进行了研究。在含量测定时，笔者以葡萄糖为标准，采取硫酸-苯酚法间接测定灰树花多糖的含量。

1 仪器与材料

UV-2102 PCS型紫外-可见分光光度计（日本尤尼柯（上海）仪器有限公司）；层析柱（上海沪西分析仪器厂，1.6 cm×50 cm）；BS2000S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；旋转蒸发仪（瑞典Buchi公司）；超细匀浆器（上海弗鲁克液体制造有限公司）。

灰树花多糖（中国海洋大学海洋药物与食品研究所，批号：20090401）；胆固醇（天津市博迪化工有限公司：批号：20080415）；大豆卵磷脂（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20090220）；Sephadex G-200型葡聚糖凝胶（美国安玛西亚公司，批号：LHS0127）；葡萄糖等试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 脂质体的制备

2.1.1 反向蒸发法 将胆固醇与大豆卵磷脂以一定的摩尔比溶于一定量氯仿中，置于250 mL圆底烧瓶中，30℃减压蒸发除去氯仿，使烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜后加入乙醚溶解，加入一定量含灰树花多糖的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.0）形成两相体系，水浴超声，至形成稳定的W/O型乳剂，减压旋转蒸发，形成胶态后加入一定量PBS，继续旋蒸15 min，除去有机溶剂，用超细匀浆器以30 000 r·min-1处理3 min，在氮气环境下定速磁力搅拌2 h，使脂质体充分吸胀，得灰树花多糖脂质体。

2.1.2 乙醚注入法 在氮气流下将溶有膜材（胆固醇、大豆卵磷脂）的乙醚，定速磁力搅拌下用注射器缓慢注入55℃的含灰树花多糖的PBS（pH 7.0）中，不断搅拌至乙醚除尽，超声30 s，即得灰树花多糖脂质体。

2.1.3 乙醇注入法 在55℃磁力搅拌下，用注射器缓慢将溶有胆固醇、大豆卵磷脂的乙醇注入至含灰树花多糖的PBS（pH 7.0）中，减压蒸发除去乙醇，超声30 s，即得灰树花多糖脂质体。

2.1.4 薄膜分散法 将胆固醇与大豆卵磷脂的混合物溶于一定量乙醚中，置于250 mL圆底烧瓶中，30℃减压蒸去乙醚，当烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜后，加入含有灰树花多糖的PBS，使瓶壁薄膜洗脱，在氮气环境下水化2 h，超声30 s，即得灰树花多糖脂质体。

2.2 脂质体的分离及包封率的测定

2.2.1 标准溶液的制备 精密称取干燥至恒重的葡萄糖适量，用纯水配制成每1 mL中含葡萄糖0.1 mg的溶液，即得标准溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取灰树花多糖8 mg，用适量纯水溶解，合并转移至100 mL量瓶中，加纯水定容，摇匀，即得80 mg·L-1的供试品溶液。

2.2.3 分离条件的选择 经多次预试验，笔者最终采用葡聚糖凝胶（SephadexG-200）层析法作为灰树花多糖脂质体的分离方法。层析条件为层析柱径高比为1∶15，上样量为0.2 mL，洗脱液为脱气PBS（pH 7.0），流速为1/3 mL·min-1。分别上样灰树花多糖、空脂质体及灰树花多糖脂质体，每3 min收集1管，共收集75 min，每隔一管用硫酸-苯酚比色法在490 nm波长处测定吸光度。

2.2.4 游离灰树花多糖的线性关系统考察[5]精密吸取0.1 g·L-1的葡萄糖标准溶液100、150、200、250、300、350、400 μL，各以纯水补至500 μL。以500 μL纯水为空白，各加入6%苯酚溶液300 μL和浓硫酸1.5 mL，摇匀，室温放置10 min后于沸水浴加热20 min，冰水浴中冷却至室温后于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖的浓度（C，μg·mL-1）对吸光度（A）进行线性回归，制备标准曲线。

2.2.5 游离灰树花多糖加样回收率试验 精密吸取供试品溶液250 μL，共15份，在490 nm波长处测定吸光度，并计算灰树花多糖含量。精密吸取0.05、0.15、0.35 mL的标准溶液各5份，分别加入到上述溶液中，同上法测定，计算加样回收率。

2.2.6 层析柱回收率试验 分别以浓度为0.8、0.6、0.4 mg·L-1的供试品溶液0.2 mL上样至Sephadex G-200型凝胶柱，收集含灰树花多糖的洗脱液，定容至一定体积，在490 nm波长处测定吸光度，计算层析柱回收率。

2.2.7 包封率的测定 将“2.1”项下制备的4种灰树花多糖脂质体，按“2.2.3”项下条件分离，用硫酸-苯酚法测定分离后游离灰树花多糖的含量。根据下式计算包封率：包封率＝（W0－W1）/W0×100%。其中，W0为制剂中加入的灰树花多糖总量；W1为游离灰树花多糖含量。

2.3 形态学观察

取灰树花多糖脂质体，PBS稀释，滴加3%的磷钨酸染色，铜网蘸取少许混合液，干燥，在透射电镜下观察脂质体颗粒的形态及粒径大小。

3 结果

3.1 脂质体分离结果

以收集管数对其吸光度作SephadexG-200型凝胶柱流出曲线图。结果，灰树花多糖脂质体和游离灰树花多糖能够很好的分离，其中管数为6～10之间为灰树花多糖脂质体吸收峰，14～19之间为游离灰树花多糖的吸收峰。SephadexG-200凝胶柱流出曲线见图1。

图1 SephadexG-200凝胶柱流出曲线Fig 1 Elution curve of liposome on the SephadexG-200 gel column

3.2 游离灰树花多糖的线性关系考察结果

按“2.2.4”项下方法，得回归方程为A＝0.015 9C－0.002 9（r＝0.999 8）。结果表明，灰树花多糖浓度（以葡萄糖计）在0.05～0.35 mg·mL-1之间与吸光度呈良好的线性关系。

3.3 游离灰树花多糖加样回收率试验结果

按“2.2.5”项下方法测定。结果，平均回收率为101.32%，RSD＝1.25%（n＝15）。

3.4 层析柱回收率测定结果

按“2.2.6”项下方法测定。结果，平均回收率为92.97%，RSD＝1.08%（n＝5），表明Sephadex G-200凝胶柱对灰树花多糖吸附性较弱，且灰树花多糖浓度在0.50%～1.0%之间其吸附率较恒定。

3.5 包封率测定结果

按“2.2.7”项下方法测定包封率。结果，薄膜分散法、反向蒸发法、乙醚注入法、乙醇注入法制得的灰树花多糖脂质体包封率分别为7.99%、20.15%、16.32%、10.26%，表明反向蒸发法制备的灰树花多糖脂质体的包封率最高，薄膜分散法所得制剂的包封率最低。

3.6 形态学观察结果

利用透射电镜观察反向蒸发法制得的灰树花多糖脂质体，其形态为圆形或椭圆形，粒径400～50 nm范围内，平均粒径200 nm左右。灰树花多糖脂质体透射电镜照片见图2。

4 讨论

因灰树花多糖的分子量（Mw为180 kD，以0.02%NaN3为流动相测定）[6]较大，且为带有分支的葡聚糖，笔者尝试透析法和压滤法对灰树花多糖脂质体进行分离，效果均不理想。参照文献[7]选择不同规格的层析柱及不同型号的葡聚糖凝胶对灰树花多糖脂质体进行分离，最终选用Sephadex G-200凝胶柱为灰树花多糖脂质体的分离柱。试验中发现，上样量与流速对灰树花多糖脂质体的分离影响也较大。

由于灰树花多糖化学结构中单糖组分仅为葡萄糖，故采用葡萄糖为标准溶液、硫酸-苯酚比色法对未包封的灰树花多糖含量进行测定。该法是将多糖在酸性条件下水解为单糖后再进行测定，测定结果准确、可靠，具有较好的重现性。

图2 灰树花多糖脂质体透射电镜照片（反向蒸发法）Fig 2 Transmission electronicphotomicrograms of polysacchearides liposome P.frondosus（reverse-phase evaporation method）

本文采用了4种不同的脂质体制备方法，以反向蒸发法所得的包封率较高。从试验结果看，反向蒸发法对水溶性多糖的包封率比其他几种方法高，这为下一步灰树花多糖脂质体制备工艺优化及该制剂生物体内的药理学研究提供了试验基础和前提。

[1]张跃珍，林 军.天然药物脂质体制备研究进展[J].中国药房，2007，18（21）：1 671.

[2]马宏达，郭 涛.脂质体靶向载药系统研究进展[J].中国药房，2004，15（11）：697.

[3]Kodama N，Komuta K，Nanba H.Administration of a polysaccharide fromGrifola frondosastimulates immune function of normal mice[J].J Med Food，2004，7（2）：141.

[4]向俊霖，张 莉，王晓辉，等.尼莫地平脂质体的制备及体外透皮研究[J].中国药房，2009，20（1）：36.

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[7]高晓黎，季兴梅.葡聚糖凝胶柱色谱法测定脂质体包封率的条件筛选[J].中国药学杂志，2003，38（7）：515.

Study on the Preparation of Polysaccharides Liposome ofGrifola frondosa

GENG Chuan-xin（Dept.of Pharmacy，Qingdao Tumor Hospital of Shandong Province，Qingdao 266024，China）
YANG Hai，LIU Xue-li（Dept.of Pharmacy，Qingdao Municipal Central Hospital，Qingdao 266042，China）

OBJECTIVE：To prepare the polysaccharides liposome ofGrifola frondosa.METHODS：The polysaccharides liposome ofG.frondosawas prepared by reverse-phase evaporation method，thin-film dispersion，ether injection and ethanol injection.Encapsulation efficiency was adopted for the confirmation of preparation method.The polysaccharides liposome ofG.frondosawas separated and purified by sephadex gel chromatography.Phenol hydrate-sulfuric acid method was used to determine the content of free polysaccharides.The morphology of the liposome was detected by negative staining.RESULTS：The encapsulation efficiencies of reverse-phase evaporation method，thin-film dispersion，ether injection and ethanol injection were 20.15%，7.99%，16.32%，10.26%，respectively.The liposome was round and oval in shape with mean particle size of 200 nm.CONCLUSION：Reverse-phase evaporation method is sound method for the preparation of polysaccharides liposome，which the polysaccharides liposome ofG.frondosaprepared by have high encapsulation efficiency.The polysaccharides liposome ofG.frondosais well separated on sephadex gel chromatography.

Polysaccharides ofGrifola frondosa；Liposome；Preparation；Reverse-phase evaporation method；Sephadex gel chromatography

R283.69；R943

A

1001-0408（2010）39-3687-03

＊副主任药师。研究方向：临床药学、制剂开发。电话：0532-84961431。E-mail：qdzx08@163.com

2010-03-12

2010-08-31）