葛根异黄酮的分离与纯化

肖芳

（锡林郭勒职业学院，锡林浩特026000）

·基础研究·

葛根异黄酮的分离与纯化

肖芳*

（锡林郭勒职业学院，锡林浩特026000）

通过单因素试验和正交试验探讨了葛根异黄酮的浸取工艺，并对大孔树脂对葛根异黄酮纯化进行了详细研究。试验结果表明：浸提时，在温度为70℃的条件下，用料液比1 g∶8 mL体积分数为50%的乙醇，浸提2.5 h，葛根异黄酮浸取率最高；对6种商品化大孔树脂吸附纯化葛根异黄酮的性能进行对比筛选，发现AB－8树脂最适合葛根异黄酮的纯化；洗脱剂乙醇体积分数为70%，工作液流速为2 BV/h，浸提浓缩液pH值为5时，采用AB-8大孔吸附树脂串联柱对葛根异黄酮进行纯化，其效果最优，产品的收率和纯度都较高。

葛根；异黄酮；提取；大孔吸附树脂；纯化

AbstractTheoptimumextractingtechnologyof isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi was investigated by using the factorial and orthogonal design, and macroreticular resin was used for the purification of pureraria isoflavonoids.The results showed that 70℃，8∶1（v/w）of 50%ethanol and 2.5 hours were the optimum ondition for the extracting of isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi.The purification pueraria isoflavonoids with 6 commercial macro reticular resins was studied；the results showed that AB-8 was the most appropriateresinforthepurificationofpueraria isoflavonoids.With an ethanol desorption agent concentration of 70%，work solution speed of 2 BV/h and work solution pH of 5，contacted AB-8 resin column can reach a reasonable yield and purityofproduct.

KeywordsPueraria lobata（Wiolld.）Ohwi；Isoflavonoids；Extraction；Macro reticular resin；Purification

葛根（Radix Pueraria），是豆科植物葛（Puerar Lobatel（willd）.Ohwi）的块根，含有葛根素、葛根木糖苷、大豆甙、大豆甙元等多种异黄酮类物质，干物质含量为50 mg/100 g，其味甘、辛、性平，既是中药材又是营养丰富的食用原料，且《神农本草经》中列为中品，并为中国药典所收载。葛根中异黄酮是一种毒性极低的安全药物，具有解肌退热，生津止渴、降低心肌耗氧量、增加冠脉脑血管流量、缓减心绞痛、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、降低血压、降低血糖、调节血脂、解毒、增强机体免疫力等多种药理作用。葛根的粗提物中含多种成分，入药时，必须对粗提物进行选择分离，提高异黄酮的纯度。选择性分离的一种有效方法是利用大孔树脂吸附，大孔树脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生简单、解吸条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。

我国湖南、广西、江西及西南地区均有丰富的野生葛根资源，同时市场对葛根黄酮需求量越来越大，但我国科技投入不足，葛根异黄酮制取技术相对落后、生产效率低、耗能大、杂质含量高、产品缺乏市场竞争力，因此，本文对葛根异黄酮提取及对粗提物进行纯化提高葛根异黄酮的纯度，均有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

层析柱（上海沪西分析仪器厂）；SP-2100型紫外-可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司；KQ-1500型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；电热数码恒温水浴锅（金坛市华仪器有限公司）；RE-86旋转蒸发器（上海本波仪器有限公司）；LD5-2A离心机（北京医用离心机厂）；电子称；烘干箱等。

1.2 材料与试剂

葛根（野生，重庆合川）；葛根素（中国药品生物制品检定所）；AB-8大孔树脂（南开大学）；pH试纸；乙醇；NaOH；HCl等均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 葛根异黄酮浸提及纯化工艺流程

葛根→粉碎→乙醇浸提→过滤→浓缩→乙醇沉降水溶性杂质→浓缩→大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱→乙醇洗脱→收集洗脱液

1.3.2 葛根异黄酮含量的测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

以葛根素为标准物，用紫外分光光度法测定。准确称取葛根素标准品5 mg，置于25 mL容瓶中加体积分数为95%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，从中分别吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL溶液置于6个10 mL的试管中，各加乙醇体积分数为95%的乙醇1 mL，用蒸馏水将体积定容至10 mL，摇匀，以第一管为对照，在250 nm处测吸光值D（λ）与葛根素含量（ρ）之间的关系作为异黄酮测定标准曲线方程，该方程为D（λ）=83.4ρ－0.032，γ=0.9999，得标准曲线（见图1）。

图1 葛根异黄酮测定的标准曲线

1.3.2.2 浸提物中总异黄酮含量的测定

将浸提溶液过滤，滤液混匀，准确吸取1 mL置入100 mL容量瓶中，加入体积分数95%的乙醇至刻度，摇匀，在250 nm波长下测定其吸光度，以同样乙醇作空白，并根据标准曲线方程计算葛根中异黄酮的含量。

1.3.3 AB-8型大孔树脂预处理

将AB-8树脂先用乙醇浸泡24 h充分溶胀，湿法装柱。然后用95%乙醇洗至洗出液加适量水无白色混浊现象，再用蒸馏水洗尽醇，最后转入酸碱处理：用4B体积分数的质量分数5%HCl溶液，以5 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3 h，而后用蒸馏水以同样的流速洗至流出水pH值为中性；再用4BV的质量分数5%NaOH溶液，以5 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡3 h，而后用蒸馏水以同样的速度洗至流出水pH值呈中性。

1.3.4 葛根异黄酮的纯化

将浸提的异黄酮浓缩液上柱，控制流速3 mL/min～5 mL/min，当溶液全部吸附后，用蒸馏水洗脱至流出液为无色，然后用乙醇进行洗脱至流出液为无色，将乙醇洗脱液收集在容器中，测其吸光度，并计算出异黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1 葛根异黄酮提取的单因素试验

2.1.1 溶剂体积分数对葛根异黄酮浸提效果的影响分别用体积分数不同的乙醇溶液对葛根浸提，

可以发现随乙醇体积分数的增加，浸出物的颜色由棕黑色逐渐变为黄褐色。结果（见表1）表明：乙醇体积分数为50%时，葛根异黄酮的含量最高，浸提效果较好。

表1 乙醇体积分数对葛根异黄酮浸提效果的影响

2.1.2 固液比对葛根异黄酮浸提效果的影响

在溶剂体积分数为最佳条件时，以能浸没样品的最少溶剂量为基础，确定最低限度固液比为1 g∶6 mL，改变固液比的试验结果（见表2）表明：当固液比为1 g∶8 mL时，浸出物异黄酮含量达最高，随着固液比减小，含量略降。

表2 固液比对葛根异黄酮浸提效果的影响

2.1.3 提取时间对葛根异黄酮浸提效果的影响

在确定提取溶剂浓度、固液比之后，考察提取时间对浸提效果的影响。结果（见表3）表明：浸提2 h后基本达平衡。原因可能来自两个方面，一是生物活性成分异黄酮葛根素、大豆甙、大豆元等存在于外部的木栓层下面的外部薄层组织中，二是磨碎后的葛根粉容易被溶剂浸透，2 h后，活性物质在固相和液相的浓度就达到了平衡。

表3 提取时间对葛根异黄酮浸提效果的影响

2.1.4 提取温度对葛根异黄酮浸提效果的影响

在溶剂体积分数、固液比和提取时间都为最佳条件时，采取不同的提取温度对葛根异黄酮进行浸提，结果（见表4）表明：提取温度为70℃时效果最佳。一般来说异黄酮随温度升高而在乙醇中溶解度增大，因为温度升高异黄酮浸取液黏度减小，扩散系数增大，促使浸提速度加快，浸取率提高，浸出物异黄酮含量增加；但温度太高，会使乙醇挥发损失，致使溶剂体积分数下降，达不到最佳效果，表4中温度为90℃时黄酮含量明显降低就是此原因。同时温度太高，某些活性成分可能遭到破坏，杂质溶出增多，操作不便，故浸提时温度不能太高。

表4 提取温度对葛根异黄酮浸提效果的影响

2.2 葛根异黄酮提取的正交试验

在单因素试验的基础上，对影响葛根异黄酮浸提效果的因素进行了正交试验，因素水平见表5，正文试验结果见表6。表明，4个因素对浸出物异黄酮含量的影响与前面单因素试验结果趋势一致，对浸出物异黄酮含量影响主次关系顺序为：溶剂体积分数＞固液比＞温度＞时间；最佳的提取工艺条件为：乙醇体积分数为50%、固液比为1 g∶8 mL、时间为2.5 h、温度为70℃。

表5 正交试验因素水平表

表6 正交试验表

2.3 葛根异黄酮提取液的制备

经正交试验，得出提取葛根异黄酮的最佳组合因素，以此组合因素对葛根进行浸提，提取液异黄酮含量为2.34 mg/mL，将提取液浓缩至最小体积，加3～4倍体积分数为95%乙醇沉降水溶性高分子多糖、蛋白质杂质，经离心去除沉淀，经旋转蒸发器浓缩得葛根异黄酮提取浓缩液，经测定其葛根异黄酮的含量为11.93 mg/mL，备用。

2.4 葛根异黄酮的大孔树脂纯化

2.4.1 大孔吸附树脂对葛根异黄酮的静态吸附效果比较

将经过预处理的6种大孔树脂去除表面水后，各取2.5 g分别置于具塞磨口三角瓶中，加入异黄酮会含量为11.93 mg/mL的提取浓缩液25 mL，振荡24 h，使树脂充分吸附异黄酮后测定树脂的静态吸附效果，过滤取出吸附饱和的树脂（得滤液1），向其中加入50 mL体积分数95%乙醇振荡24 h使异黄酮解吸附，再过滤（得滤液2），分别测定滤液1和滤液2中异黄酮的含量，结果如表7。

表76 种大孔树脂对葛根异黄酮的静态吸附效果比较

由表7可以看出，6种树脂对葛根异黄酮的吸附率AB-8和ADS-5l较高，分别达到26.91%和27.49%；解吸率AB-8、HPD600和ADS-17的较高，都达到了90%以上，解吸效果非常优良；而ADS-5树脂的解吸效果一般，只有86.82%。和有关文献对比，本研究树脂对异黄酮的吸附率普遍较低，其原因可能是其他研究大都利用纯化的标准品进行实验，而本研究直接以葛根异黄酮提取浓缩液为材料，提取液中的其他成分可能是造成这种差异的主要原因。综合对比之下，AB-8树脂对葛根异黄酮的吸附效果最好，因此，下面进一步对AB-8树脂对葛根异黄酮的动态吸附进行探讨。

2.4.2 AB－8树脂的动态吸附及解吸附效果

选用D20 mm×L300 mm的层析柱，湿法装柱，树脂床体积为120 mL，料液中葛根异黄酮量为1.50 mg/mL，料液以1BV/h速度通过树脂柱床，共处理7 BV料液，每处理1BV料液的流出液单独收集，测定流出液中异黄酮的含量，结果见图2。从图2中可以看见，AB－8树脂吸附异黄酮浓度为1.50mg/mL料液时，从第二树脂床体积异黄酮就有很大泄漏，流出液中异黄酮浓度高达1.001 mg/mL，但树脂床饱和吸附可达6BV。只有树脂达到完全饱和时才能充分发挥其吸附性能，因此考虑生产中采用树脂柱串联的方法。

图2 A B-8树脂对葛根异黄酮的动态吸附效果

2.4.3 乙醇体积分数对AB－8树脂洗脱效果的影响

将浓缩液注入树脂柱中，待样品液全部通过吸附柱后，用蒸馏水洗至流出液呈澄清状态，然后再分别用不同体积分数乙醇洗脱，将洗脱液经旋转蒸发浓缩、真空干燥，测定异黄酮得量和纯度（见表8），由表8可以看出体积分数95%乙醇洗脱异黄酮收集率最高，达79.79%，而体积分数70%乙醇洗脱后异黄酮纯度最高，为34.20%，因此，本试验认为采用体积分数70%乙醇洗脱可以较好地达到纯化葛根异黄酮的目的。

表8 不同乙醇浓度对树脂洗脱效果的影响

2.4.4 流速对AB-8树脂吸附性能的影响（见表9）

表9 不同流速对AB-8树脂吸附性能的影响

从表9可知，流速不同，异黄酮的洗脱率和收率也不同，在1 BV/h～3 BV/h内，随着流速的增加，异黄酮的收率随之下降。考虑到工作的效率和异黄酮洗脱率，选用2 BV/h流速较为适当。

2.4.5 原液pH值对AB－8树脂吸附性能的影响（见表10）

表10 pH值对AB-8树脂吸附性能的影响

异黄酮类物质属多酚类化合物，pH影响异黄酮物质在水中的溶解性从而影响树脂对其吸收附性能。试验中发现葛根异黄酮原液在较低pH时，溶液呈絮状浑浊状态，而随pH增加，原液逐渐澄清，并且不同pH值原液在树脂柱中的扩散转移速度也有明显差异，pH值越低，其扩散转移速度越慢。由表10可以看出，其纯度随pH值变化的而变化，pH3时，产物纯度最高，达48.98%；而pH5时，收率最高，达2.31%。但是试验中发现pH值为3和4时，絮状物在树脂柱上部形成沉淀，对树脂床污染和堵塞严重，因此认为适宜pH值为5。

3 结论

用乙醇溶液提取葛根异黄酮时，通过四组单因素试验和四因素三水平正交试验，以及用大孔树脂纯化葛根异黄酮，通过四组单因素的试验，试验结果表明：

a）提取葛根异黄酮时，溶剂乙醇体积分数为50%、固液比为1 g∶8 mL、提取温度为70℃、提取时间为2.5 h时，浸出物中异黄酮的含量最高。

b）对6种树脂吸附葛根异黄酮性能进行对比筛选，发现AB－8树脂最适合葛根异黄酮的纯化。实验结果表明，洗脱剂乙醇体积分数为70%、工作液流速为2BV/h、浸提浓缩液pH值为5时，采用AB-8大孔吸附树脂串联柱对葛根异黄酮进行纯化，其效果最优，产品的收率和纯度都较高。

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Extracting and purification ofIsoflavonoids from pueraria lobata(Wiolld.)Ohwi

XIAOFang*
（XiLinGuoLe vocational college，Xilinhaote 026000，China）

*肖芳，女，1977年出生，2003年毕业于西南农业大学，食品科学与工程专业，讲师。

2010-05-24