扁平苔藓皮损中MIF、MMP-9的表达及意义

王 慧，白 莉

（山西医科大学第一医院皮肤科，山西太原 030001）

扁平苔藓（lichen planus）是一种病因不明的慢性或亚急性炎症性皮肤病，其组织学特征显示为上皮基底细胞的液化变性、基底膜带损伤。目前关于其基底膜带损伤机制的研究甚少。本文旨在检测扁平苔藓中MIF、MMP-9的表达，进一步探讨两者与扁平苔藓基底膜带损坏的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

病例组30例均系2008～2009年在我院皮肤科就诊，经临床和病理确诊的扁平苔藓患者。其中，男17例，女13例；年龄20～64岁，平均41.9岁。所有患者在半年内均未使用过激素和免疫抑制剂治疗。于患者典型皮损处取材。对照组30例为同期在我院整形科、普外科所取的正常皮肤组织，其中，男20例，女10例；年龄 18～60岁，平均37.6岁。两组患者年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。各标本取材后分两份，一份经中性福尔马林液固定，石蜡包埋后用于免疫组化染色；另一份予以液氮迅速冷冻后置于-80℃冰箱保存，用作RT-PCR实验。

1.2 试剂

兔抗人MIF多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，兔抗人MMP-9多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。二步法PV-6000免疫组织化学检测试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。MIF、MMP-9引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法 采用PV-6000二步法：备用标本进行4 μm厚连续切片后脱蜡，3%H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶； 滴加一抗 （MIF浓缩液1∶150稀释，MMP-9浓缩液1∶100稀释），37℃孵育 1 h； 滴加二抗 PV-6000，37℃孵育 20 min；二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染、脱水、封片。

1.3.2 RT-PCR法 采用Trizol一步法提取各标本总RNA，并用分光光度法检测其浓度及纯度。加入逆转录反应体系合成cDNA，将其置于PCR反应体系，按RT-PCR试剂盒说明扩增GAPDH （作为内参照）、MIF、MMP-9。各基因引物如下，GAPDH 上游引物：5′-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′，下游引物∶5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′，扩增片段 307 bp。MIF 上游引物：5′-AGA ACC GCT CCT ACA GCA AG-3′， 下游引物：5′-ATT TCT CCC CAC CAG AAG GT-3′，扩增片段234 bp。MMP-9上游引物：5′-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3′，下游引物：5′-GCC ATT CAC GTC GTC CTTAT-3′，扩增片段179bp。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性 30 s， 58℃（GAPDH）、52℃（MIF）、56℃（MMP-9）退火 20 s，72℃延伸30 s，共32次循环。获得的PCR产物经1.5%琼脂凝胶电泳后，用图像分析仪扫描分析。

1.4 结果判定

免疫组化结果以细胞核或细胞浆着黄色或棕黄色为阳性，每张切片随机选取5个视野，利用MIAS-2000图像分析系统分析阳性区域积分光密度（IOD）值，以IOD值大小代表阳性产物的多少；RT-PCR检测结果以出现扩增条带为阳性，PCR产物的含量以累积光密度（OD）表示。以同一标本MIF、MMP-9与内参照GAPDH的OD值来判定两种组织中MIF、MMP-9的表达水平。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 扁平苔藓组织与正常皮肤组织中MIF、MMP-9的表达水平

免疫组化结果显示，扁平苔藓中MIF、MMP-9的阳性表达主要分布在表皮全层角质形成细胞和真皮浅层浸润的淋巴细胞的胞浆中；而在正常皮肤组织中均呈阴性或弱阳性表达。两者在扁平苔藓皮损区的表达明显高于正常皮肤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。扁平苔藓皮损中 MIF、MMP-9的表达呈正相关（r=0.636， P＜0.01）。扁平苔藓组与正常皮肤组之间MIF、MMP-9的IOD值比较见表1。

表1 扁平苔藓与正常皮肤组织中MIF、MMP-9表达水平的比较（±s）Tab.1 The expression of MIF and MMP-9 in lichen planus and normal skin(±s)

表1 扁平苔藓与正常皮肤组织中MIF、MMP-9表达水平的比较（±s）Tab.1 The expression of MIF and MMP-9 in lichen planus and normal skin(±s)

组别 例数 MIF 30 30扁平苔藓组正常皮肤组t值 P值--12.374±1.365 6.373±1.693 15.111 0.000 MMP-9 14.189±1.538 7.094±2.038 15.221 0.000

2.2 扁平苔藓与正常皮肤组织中MIF、MMP-9 mRNA的表达水平

RT-PCR结果显示，各组织均稳定表达内参照基因GAPDH。经统计学分析扁平苔藓皮损中MIF的mRNA、MMP-9的mRNA表达水平显著高于正常皮肤，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 扁平苔藓与正常皮肤组织中MIF、MMP-9 mRNA表达水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of the expression of MIF and MMP-9 mRNA in lichen planus and normal skin(±s)

表2 扁平苔藓与正常皮肤组织中MIF、MMP-9 mRNA表达水平的比较（±s）Tab.2 Comparison of the expression of MIF and MMP-9 mRNA in lichen planus and normal skin(±s)

扁平苔藓组正常皮肤组t值P值组别 例数 MIF/GAPDH 30 30--0.907±0.091 0.553±0.075 16.454 0.000 MMP-9/GAPDH 0.959±0.059 0.635±0.081 17.759 0.000

3 讨论

目前广泛认为扁平苔藓是一种细胞介导的自身免疫性疾病。研究证明，CD8＋T细胞与LP皮损的基底细胞损伤以及皮损的持续存在有关[1]。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是由活化的T淋巴细胞分泌的一种淋巴细胞因子。它通过抑制巨噬细胞迁移，使巨噬细胞在炎症局部激活、黏附、浸润并分泌一些细胞因子，这些因子又可促进MIF的分泌，从而造成一个慢性反复的炎症过程。MIF可作为免疫调节剂参与机体各种病理生理过程，在自身免疫疾病以及抗原递呈过程中起重要作用[2]。最近的研究也发现T淋巴细胞内MIF的水平为B淋巴细胞和巨噬细胞中的2倍[3]。本研究显示，MIF在扁平苔藓中的表达明显高于正常皮肤，因此推测MIF的过度表达可能在扁平苔藓的发病中起重要作用。

MMP-9属于MMPs中的明胶酶，多来源于T淋巴细胞、巨噬细胞，主要降解基底膜带中的重要成分Ⅳ型胶原和层黏连蛋白，从而造成基底膜带的损坏。本实验结果显示扁平苔藓中MMP-9表达增高，表明MMP-9可能与扁平苔藓基底膜带破坏有关，这与丁政云等[4]的研究结果一致。

有研究证明MIF能诱导MMP-9的表达上调[5-6]，且研究认为MMP-9基因启动子区有几个可以与转录因子相结合的位点，包括NF-κB和活化蛋白-1（AP-1）等元件的结合位点，这些活化因子的结合是MMP-9表达所必需的[7]。MMP-9的转录有赖于一些细胞因子、生长因子等与这些元件的相互作用。本研究表明，扁平苔藓中MIF、MMP-9的蛋白及mRNA均升高，且二者表达呈正相关，提示MIF可能通过一系列途径上调MMP-9的转录活性而最终调节MMP-9蛋白水平的增高。激活的MMP-9使基底膜带遭到破坏，除可使OLP表皮细胞失去生存信号而凋亡外，还使更多的淋巴细胞进入上皮加剧其损伤[8]。凋亡的表皮细胞又无法合成基底膜带的主要成分Ⅳ型胶原和层黏连蛋白，加重了基底膜带的损伤。这一连锁反应最终可致基底细胞液化变性，产生扁平苔藓的临床和病理变化。

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