基于cdd基因敲除和嘧啶操纵子转移的胞苷产生菌的研究

苏 静，邓培生，谢希贤，陈 宁

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

基于cdd基因敲除和嘧啶操纵子转移的胞苷产生菌的研究

苏 静，邓培生，谢希贤，陈 宁

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

以大肠杆菌作为出发菌株，通过基因工程手段对其进行改造，旨在提高胞苷产量．首先，通过Red重组系统敲除了大肠杆菌MG3028基因组上的胞苷脱氨酶基因(cdd)，阻断了胞苷的分解代谢．然后，构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021，并将其转入E.coli MG3028(△cdd)．与出发菌株E.coli MG3028相比，E.coli MG3028(△cdd)的胞苷产量提高了近2倍，而尿苷产量降低了近75%，携带重组质粒pPYR3021的菌株胞苷产量较出发菌株提高了近6倍．

大肠杆菌；胞苷脱氨酶；嘧啶操纵子；Red重组；胞苷

胞苷是人体和动植物体内RNA的结构组成部分，在生物体内生理生化过程中起着重要的调控作用，具有多方面生理活性．同时，胞苷又是很多抗病毒、抗肿瘤和抗艾滋病药物的良好中间体以及基因工程研究的重要原材料[1]．采用微生物发酵法生产胞苷，具有条件简单、成本低、产率高、周期短、控制容易等优势[2]，是大规模生产胞苷的首选技术．经过传统诱变得到的菌株会产生大量次级突变，具有菌体生长速度慢等弱点，是目前工业生产中难以解决的问题．基因工程技术改造菌株，如基因克隆、基因敲除等，因其无次级突变、改造目的性强、实验周期短等优势逐渐受到人们的重视．

在大肠杆菌胞苷从头合成途径中，尿苷酸(UMP)合成酶系和三磷酸(CTP)胞苷合成酶系受到尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的反馈抑制，而胞苷脱氨酶使胞苷进一步反应生成尿苷[3–4]．本文为了提高胞苷产量，首先利用Red重组系统敲除了胞苷脱氨酶基因cdd，切断胞苷进一步代谢为尿苷的分解途径，构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021，此操纵子编码UMP从头合成途径中的6个关键酶．发酵研究表明，经过这些改造后，胞苷产量有了不同程度的提高，这为进一步选育胞苷生产菌奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

Escherichia coli MG3028是本实验室筛选得到的一株胞苷产生菌株．解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TS8是本实验室通过诱变得到的一株胞苷产生菌，它带有5–氟胞苷(5-FCr)和3–脱杂氮尿嘧啶(3-DUr)抗性．质粒pMU3021(含有四环素抗性基因)、pMD18-T、pKD3(含有氯霉素抗性基因)、pKD46(温敏型复制子，含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，Ampr)、pCP20(同时含有氯霉素和氨苄青霉素抗性基因)由天津科技大学代谢工程研究室保存．

1.2 试剂与试剂盒

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、质粒载体pMD18-T，TaKaRa公司；PCR引物，上海生物工程公司；1,000,bp marker，Fermentas公司；L–阿拉伯糖，北京新经科生物技术公司；DNA片段胶回收试剂盒、基因组DNA的提取试剂盒、质粒小样快速提取试剂盒，北京博迈德公司；IPTG、X-gal、溶菌酶、氨苄青霉素及氯霉素，北京索莱宝公司；蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司；其余试剂均为国产分析纯．

1.3 培养基

种子培养基：葡萄糖20,g，玉米浆50,mL，豆饼水解液20,mL，酵母膏15,g，(NH4)2SO410,g，柠檬酸三钠0.5,g，MgSO4·7H2O,5,g，KH2PO41.5,g，FeSO4·7H2O 15 mg，VB1100 mg，蒸馏水1 000 mL．

发酵培养基：葡萄糖20,g，玉米浆5,mL，豆饼水解液25,mL，酵母膏1,g，柠檬酸三钠2,g，MgSO4·7H2O,5,g，KH2PO4,2,g，FeSO4·7H2O,100,mg，蒸馏水1,000,mL．

SOC培养基：胰蛋白胨20,g，酵母提取物5,g，NaCl,0.5,g，KCl 2.5,mmol,，MgCl210,mmol，葡萄糖20,mmol，蒸馏水1,000,mL．

1.4 引物设计

本文所用引物：P1(5′-AAAGCCACAACGGGT TCGTAAACTGTTATCCCATTACATGATTATGAG GCAACGCC TTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3′)，P2(5′-ACCAGGAGAGGGCTGGCAAGCCGGAC A A G G C G T T C A C G C C G C A T C C G G C A C CAGGC TAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3′)，P3(5′-GCTGGATTATCAGGAAGGT-3′)，P4(5′-TAACAGGCTGAGGAACACG-3′)，P5(5′-GAGACT CGAG GGAAACGGAGGAGAAAAACAT-3′)，P6 (5′-GAGAGCGGCCGC GCTGTTGTTTTCTGCCGG TTGTC-3′)，P7(5′-GAGAGCGGCCGC GGCTATTC CGGGTACCATTCGC-3′)，P8(5′-GAGACTCGAGC GCGATCAACAAGGAATTCCAGTG-3′)，由北京博迈德公司合成．设计引物P1、P2，引物5′端56,bp(下划线所示)与待敲除的靶基因同源，3′端23,bp与pKD3上的氯霉素基因同源，中间序列为FRT位点．以P1、P2为引物，PCR扩增出pKD3上的氯霉素基因．根据大肠杆菌MG3028 cdd基因及上下游序列设计鉴定引物P3、P4．根据解淀粉芽孢杆菌基因序列，设计引物P5、P6，PCR扩增出嘧啶操纵子序列．根据质粒pMU3021的基因序列设计引物P7、P8，扩增出质粒pMU3021上包括复制起始位点、启动子、四环素抗性在内的结构元件．

1.5 方法

1.5.1 利用Red重组系统构建大肠杆菌cdd基因缺失株

感受态的制备[5]：将含有pKD46的大肠杆菌MG3028接种，30,℃过夜培养12,h，2%接种至100,mL的LB培养基(氨苄青霉素的质量浓度为100,μg/mL)，30,℃培养至A600为0.2～0.3时，加入L–阿拉伯糖至100,mmol/L，继续培养至 A600为0.5～0.6，充分表达pKD46上的Exo、Bet和Gam 3个蛋白．菌体预冷至4,℃，10,000,r/min离心10,min，弃培养基，用预冷的无菌水洗涤1次，用预冷的10%甘油离心洗涤3次，用600,μL 预冷的10%甘油重悬细胞，每管50,μL分装，存放于－80,℃冰箱待用．

氯霉素抗性基因片段的扩增：以质粒pKD3为模板，P1、P2为引物，PCR扩增出含有氯霉素抗性基因的目的片段．

氯霉素抗性基因替换拟敲除的目的基因cdd：将扩增得到的1,166,bp片段约120,ng加入上述制备好的感受态细胞中，混匀，转入0.2,cm电击杯中，用Bio-Rad电击仪做电转化[6]．电击电压1.8,kV，电击时间为5～6,ms，电击后迅速加入1,mL的SOC培养基，165,r/min、37,℃培养2,h后涂于含有氯霉素的平板(氯霉素质量浓度为34,μg/mL)上．过夜培养后用菌落PCR鉴定含氯霉素抗性基因的重组菌．

抗性基因的消除及鉴定：pCP20质粒[7–8]含有一个翻转重组酶(FLP)基因，42,℃诱导表达的FLP重组酶可以与FRT位点结合，FRT位点自身发生同源重组，从而消除一个FRT位点及抗性基因．pCP20的复制起点为温度敏感型，在42,℃高温下不能复制．

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，37,℃复苏2,h，在含有100,μg/mL氨苄青霉素平板上筛选转化子．筛选的转化子42,℃过夜培养，分别涂布于含25,μg/mL氯霉素平板和无抗性平板，挑选在无抗性平板上生长而在氯霉素平板上不生长的单菌落即为抗性基因消除的菌株．以P3、P4为引物，对氯霉素抗性消失的克隆进行PCR鉴定，PCR产物进行测序验证．

1.5.2 质粒构建及转化

以解淀粉芽孢杆菌TS8染色体DNA为模板，P5、P6为引物，PCR扩增出嘧啶操纵子的结构基因，同时，以P7、P8为引物扩增出质粒pMU3021上包括复制起始位点、启动子、四环素抗性在内的部分结构元件．将纯化的两段PCR产物酶切连接起来，构建成质粒pPYR3021(图1)，在这个质粒上，pyr基因受pMU3021质粒的启动子的调控．

图1 质粒pPYR3021的构建Fig.1 Construction of plasmid pPYR3021

在1.5,mL无菌离心管中加入1,μL质粒DNA和200, μL大肠杆菌MG3028(△cdd)感受态细胞，轻弹管壁混匀，冰上放置30,min．将离心管置于42,℃的恒温水浴90,s后，快速将离心管冰浴3,min．向离心管中加入500, μL的LB液体培养基，37,℃振荡培养1,h．取150, μL的LB液体培养基菌悬液，涂布到含50,μg/mL四环素抗性的LB平板上，37,℃恒温培养12,h后筛选转化子，得到重组菌株MG3028 (△cdd/ pPYR3021)．

1.5.3 菌体浓度测定

取0.2,mL待测液，加入9.8,mL,0.25,mol/L的盐酸以溶解溶液中的碳酸钙，摇匀，以空白培养液为参比，752型分光光度计测定A600．

1.5.4 胞苷和尿苷的测定[9]

采用HPLC测定反应生成的胞苷和尿苷．

1.5.5 菌株传代培养[10]

从胞苷产生菌MG3028(△cdd/pPYR3021)中挑取单菌落接种于含50,μg/mL四环素的LB液体培养基中，37,℃、200 r/min过夜培养，第2天按1%的接种量接种不含四环素的LB液体培养基中，37,℃连续振荡培养，每隔6,h转管，间隔一定时间取样，取得不同代数的菌液．分别取第0、20、40、60、80、100代菌株适量稀释，涂布于空白LB平板，37,℃过夜培养，分别挑取100个单菌落到空白LB平板和含四环素的LB平板，37,℃过夜培养，计算工程菌在无四环素选择压力下传代时质粒丢失率．

2 结 果

2.1 cdd基因敲除及鉴定

将扩增出的氯霉素抗性基因片段转化到含有质粒pKD46的MG3028感受态细胞中，37,℃复苏2,h后涂布于氯霉素抗性平板上培养约24,h．以P3、P4为引物，PCR鉴定氯霉素抗性平板上长出来的阳性转化子．cdd基因敲除前用鉴定引物PCR扩增出的片段为1,305,bp，敲除后用鉴定引物PCR扩增出的片段为1,474,bp．结果显示：PCR扩增的目的条带与理论值一致，如图2(a)所示．

图2 cdd基因敲除鉴定结果Fig.2 Verification of cdd gene knockout

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，37,℃复苏2,h，在含有100,μg/mL氨苄青霉素平板上筛选转化子．挑选出的转化子42,℃培养过夜后，分别涂布于氯霉素抗性平板和无抗性平板，挑选在无抗性平板上生长而在氯霉素平板上不生长的单菌落，用鉴定引物P3、P4作进一步鉴定．氯霉素抗性基因缺失后，用鉴定引物PCR扩增出的片段为544 bp．琼脂糖凝胶电泳结果与理论值一致，如图2(b)所示．

2.2 含嘧啶操纵子的表达载体pPYR3021的构建及转化子筛选

以P5、P6为引物，PCR扩增出嘧啶操纵子的结构基因；同时，以P7、P8为引物扩增出质粒pMU3021上包括复制起始位点、启动子、四环素抗性在内的结构元件．分别用限制性内切酶Xho I和Not I双酶切两段纯化的PCR产物，然后将酶切片段连接起来，构建成质粒pPYR3021，转化敲除了cdd基因的大肠杆菌MG3028(△cdd)．在含50,μg/mL四环素抗性的LB平板上，筛选转化子，得到重组菌株MG3028(△cdd/ pPYR3021)．提取质粒测序，结果表明构建成功．

2.3 基因改造对菌体生长的影响

将出发菌株大肠杆菌MG3028、敲除了cdd基因的MG3028(△cdd)和含有质粒pPYR3021的MG3028 (△cdd/pPYR3021)摇瓶发酵40,h，根据发酵液不同时期的吸光度绘制生长曲线，如图3所示．结果表明，敲除了cdd基因其生长曲线与出发菌株MG3028基本一致，它们到达对数生长期与进入稳定期的时间无明显差别，而转入重组质粒pPYR3021后，菌株生长周期加长，其到达对数生长期延长了2 h，且菌体浓度最高只能达到1.623，原因可能是重组质粒太大，它的存在对菌株的生长造成了一定的压力．由此说明，敲除cdd基因对大肠杆菌MG3028的生长状况没有太大影响，而转入重组质粒对菌株的生长有一定的影响．

图3 大肠杆菌MG3028、MG3028(△cdd )、 MG3028 (△cdd/pPYR3021)的生长曲线Fig.3 Growth curve of Escherichia coli MG3028，MG3028 (△cdd)and MG3028(△cdd/pPYR3021)

2.4 敲除cdd基因和过表达嘧啶操纵子pyr基因对大肠杆菌胞苷积累的影响

将cdd基因缺失突变株MG3028(△cdd)和转化了质粒pPYR3021的MG3028(△cdd/pPYR3021)进行摇瓶发酵实验，同时以出发菌株大肠杆菌MG3028作为对照菌株，HPLC分析胞苷和尿苷的变化．结果如图4所示，cdd基因缺失突变株MG3028(△cdd)胞苷产量为(0.181±0.012)g/L，较出发菌株略有提高，而尿苷产量明显降低，说明敲除cdd基因可有效地阻断嘧啶代谢通量由胞苷流向尿苷和尿嘧啶，使胞苷有所积累．转化质粒pPYR3021后，胞苷产量由出发菌株MG3028的(0.098±0.004)g/L增加到(0.580±0.026) g/L．同时，尿苷产量也略有增加，说明过表达嘧啶操纵子基因pyr，可以显著增强嘧啶代谢途径，胞苷产量有所提高．

图4 大肠杆菌MG3028、MG3028(△cdd)、MG3028 (△cdd/ pPYR3021)胞苷产量的比较Fig.4 Cytidine yield of E.coli MG3028，MG3028(△cdd)and MG3028(△cdd/pPYR3021)

2.5 含嘧啶操纵子重组质粒pPYR3021稳定性测定

工程菌株MG3028(△cdd/pPYR3021)在没有筛选压力下的质粒稳定性如表1所示．结果说明在没有筛选压力下质粒不稳定，到第100代时质粒丢失率达到了22%．

表1 质粒稳定性Tab.1 Plasmid stability

3 讨 论

目前，利用发酵法生产胞苷的菌株大部分为芽孢杆菌属，主要原因是芽孢杆菌属的嘧啶核苷代谢通量大，相关酶基因集合成簇，反馈阻遏和反馈抑制易于解除，适合选育胞苷产生菌，但该菌是革兰氏阳性菌，载体受体系统研究少，且有质粒不稳定的障碍，所以采用基因工程技术修饰改造枯草芽孢杆菌难度较大，相关的研究报道也较少．相比于枯草芽孢杆菌，大肠杆菌具有遗传背景清晰、基因操作简单和异源基因兼容性好等特点，已成为基因工程研究方面应用最广泛的宿主菌．

基于大肠杆菌在基因工程操作方面的优势，本文选择大肠杆菌作为出发菌株．首先，利用Red重组系统敲除了MG3028上的胞苷脱氨酶基因(cdd)，构建出cdd基因缺失突变株，与出发菌株相比，此菌株胞苷产量提高了近2倍，尿苷降低了近75%，说明阻断胞苷降解通路对提高胞苷浓度也是必要的．

不同于大肠杆菌的嘧啶操纵子不连续地分散在染色体上[11]，构成解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子的6个结构基因是连接在一起的．解淀粉芽孢杆菌TS8是通过诱变筛选得到的一株胞苷产生菌，它带有5-FCr和3-DUr抗性，在一定程度上解除胞苷生物合成途径中所受反馈抑制与反馈阻遏．本文将TS8嘧啶操纵子引入大肠杆菌，以增强受体菌嘧啶代谢流通量．当把重组质粒pPYR3021转入cdd基因缺失突变株，胞苷产量提高了近6倍，同时，尿苷也略有提高，说明过表达嘧啶操纵子基因，可以显著增强嘧啶代谢途径，增加胞苷产量．

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Study on Cytidine Producing Strain Based on cdd Gene Knockout and Pyrimidine Operon Transfer

SU Jing，DENG Pei-sheng，XIE Xi-xian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To enhance production of cytidine，Escherichia coli was manipulated by using genetic engineering methods. The cdd gene of Escherichia coli MG3028 was knocked out to block cytidine degradation by Red recombination system. Then the recombinant plasmid pPYR3021 containing pyrimidine operon of Bacillus amyloliquefaciens TS8 was constructed and transformed into E.coli MG3028(△cdd). Compared with original strain MG3028，knockout of the cdd gene led to the enhanced production of cytidine by nearly 2-fold，and reduced production of uridine by 75%. The production of recombinant strain harboring a plasmid pPYR3021 was improved by 6-fold.

Escherichia coli；cytidine deaminase；pyrimidine operon；Red recombination；cytidine

Q784

：A

：1672-6510(2010)05-0001-05

2010-01-20；

2010-05-17

苏 静（1984—），女，天津人，硕士研究生；通信作者：陈 宁，教授，ningch@tust.edu.cn.