甘草酸提取与精制工艺优化

佘金明 , 刘有势, 谢显珍, 梁逸曾

(1. 中南大学 化学化工学院中药现代化研究中心, 长沙 410083; 2. 湖南工业大学 科技学院, 湖南 株洲 412008; 3. 常德职业技术学院 药学系, 湖南 常德 415000)

甘草酸提取与精制工艺优化

佘金明1,3, 刘有势2, 谢显珍3, 梁逸曾1

(1. 中南大学 化学化工学院中药现代化研究中心, 长沙 410083; 2. 湖南工业大学 科技学院, 湖南 株洲 412008; 3. 常德职业技术学院 药学系, 湖南 常德 415000)

采用氨性乙醇溶液从甘草中提取甘草酸, 以甘草酸含量为指标, 结合单因素研究的结果, 运用正交实验法对提取温度、料液比和酸沉pH值等因素进行工艺优化; 再通过静态吸附、动态吸附与解吸实验, 筛选出D-101型大孔树脂及纯化的最佳工艺条件, 为甘草酸的提取与精制提供理论依据.

甘草酸; 正交试验; 提取精制; 大孔树脂

1 材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 原辅试剂

乌拉尔甘草(新疆阜康乌拉尔甘草种植有限公司), D-101、AB-8、DA-301、DA-201等大孔树脂(天津市海光化工有限公司), 氨水、乙醇、活性炭等药品均为分析纯.

1.1.2 仪器设备

FW135微型粉碎机(上海安锐自动化仪表有限公司), 800-1离心机(北京惠智仪诚科研发展有限公司), RE-5299旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司), SHB-3真空抽气装置(河南太康科教仪器厂), JA5103N型分析天平(上海达平仪器有限公司), DZKW-4恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司), UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津)等.

1.2 实验方法

1.2.1 甘草酸的提取

采用热回流装置, 用氨性醇溶剂从甘草中提取甘草酸. 在500 mL的三口烧瓶中, 加入50 g过2号筛的甘草细粉末, 加入规定量的提取液, 混合浸渍1 h, 连接冷凝管、抽气装置等. 在设定温度下恒温水浴加热规定时间后, 停止加热, 趁热抽滤, 将滤液离心并取上层清液, 再用相同方法对甘草滤渣进行第2次提取(溶剂、时间为原来的2/3). 合并两次离心后所得的溶液, 于旋转蒸发仪中浓缩至原体积的1/5, 用3.0 mol⋅ L-1的H2SO4调节浓缩后溶液的pH值到规定范围, 低温静置待甘草酸沉淀不再增加为止, 抽滤, 用蒸馏水润洗2次, 干燥至恒重, 得到棕黄色甘草酸粉末粗品, 并用分析天平称其质量.

1.2.2 甘草酸的精制

大孔吸附树脂法[11]是20世纪70年代发展起来的一种新工艺, 已广泛应用于天然药物的分离与纯化,成为精制有机化合物尤其是水溶性化合物的有效手段. 它具有吸附容量大、再生简单、效果可靠等特点,是一种较为经济实用的方法. 通常选用的树脂有Amblite XAD4, XAD8, XAD9, XAD11, DA201, AB-8和D101等类型. 其基本的工艺流程[12]为:

提取粗品→热水溶解→调pH值→上柱吸附→水或稀醇洗脱→浓缩→脱色→重结晶→纯品.

1.2.3 甘草酸的含量测定

甘草酸含量的测定方法很多, 有重量法、比色法、紫外-可见分光光度法等传统方法及高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法(TLC)、气相色谱法(GC)和毛细管电泳法(CE)等现代方法[13]. 本实验采用重量法和紫外-可见分光光度法测定甘草中甘草酸的含量.

重量法: 甘草酸% = (精制后的甘草酸质量/甘草细粉的质量)×100%

2 结果与讨论

2.1 单因素对甘草酸提取的影响

通过考查相关资料, 确定氨水浓度(0.5%)、乙醇浓度(40%)、提取时间(2 h)、甘草颗粒大小(过2号筛)、温度(60℃)、料液比W/V(1:10)、酸沉pH(1.5)值等作为考查单因素影响提取效果时的固定条件. 每次取过筛后的甘草粉末50 g按1.2.1的方法提取甘草酸.

2.1.1 氨水浓度

在上述条件中, 将氨作为变量, 其它因素不变, 结果如图1所示. 在溶剂水中加入氨, 改变了甘草酸的电离状态, 从而增加甘草酸的水溶性. 当氨水浓度上升至0.5%以后, 随着浓度升高, 产率增加缓慢, 当超过0.75%时, 产率逐渐降低, 并有氨气向外逸出, 造成环境污染. 所以氨水的加入有利于甘草酸的提取, 其浓度在0.1～0.8%范围内对甘草酸的影响较大, 但不宜过高, 以0.5%左右适宜.

2.1.2 乙醇浓度

如果将乙醇作为变量, 实验结果如图2所示. 在溶剂水中加入乙醇, 引起提取溶剂物理性质(如极性、密度、粘度及介电常数等)的变化, 尤其是溶剂极性的变化, 从而影响甘草酸的提取. 随着乙醇浓度的增加, 产率上升, 当乙醇浓度达到40%时产率最大. 当乙醇浓度继续增大时, 甘草酸得率下降, 这是由于甘草酸在过高浓度的乙醇中溶解度降低所致, 同时为了降低其成本, 确定30%作为控制乙醇浓度的最佳条件.

图1 氨水浓度对甘草酸提取率的影响

图2 乙醇浓度对甘草酸提取率的影响

2.1.3 提取时间

时间作为变量的实验结果如图3所示. 随着提取时间的延长产率增加, 但达到一定时间后, 物料内部和溶剂中的溶质达到了平衡, 继续提取意义不大, 反而增加提取成本. 因此, 提取时间以2 h为宜.

2.1.4 甘草颗粒大小

甘草粒度对甘草酸提取率的影响如图4所示. 其得率随粒度减小而增加, 因为物料粒度减小, 固液两相接触面积将增大, 溶剂向甘草原料渗透的速率以及甘草酸从固体颗粒表面向溶剂传质速率都增大. 当粒度大于40目后, 得率趋于稳定. 因为粒度减小时其它可溶性成分的溶解速度也增加, 从而使得溶液的粘度增加, 溶液的扩散系数降低, 传质速率减小, 不利于甘草酸的溶出. 综合考虑, 以过2号筛的颗粒作为甘草颗粒的大小.

图3 提取时间对甘草酸提取率的影响

图4 甘草粒度大小对甘草酸提取率的影响

2.2 氨性醇提取法的工艺条件优化

根据上述单因素实验得到的结论, 选取提取温度、料液比、酸沉pH值作主要因素, 以测得的粗甘草酸收率为考察指标, 采用L9(34)表安排试验,试验因素水平见表1, 正交试验结果见表2,方差分析结果见表3.

表1 因素水平

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

从表2中直观分析, 各因素影响甘草酸提取效率的大小顺序为因素C＞因素A＞因素B, 其最佳工艺条件为A2B2C2, 与相关资料中单因素影响实验结果一致. 由于各因素的极差与误差列的极差相差很大,因此各因素间的交互作用误差可以忽略.即在该实验过程中, 提取温度为60℃, 甘草粉末质量与溶剂体积比为1:12, 酸沉pH值等于1.5为最佳的实验条件.

表3中的方差分析结果显示, 因素A、B、C对甘草酸的提取都有非常显著的影响,其影响的大小程度为:

酸沉pH＞提取温度＞料液比.

2.3 甘草酸精制的主要影响因素

2.3.1 树脂的选择及对甘草酸的静态吸附

大孔吸附树脂具有吸附性与筛选性,其吸附性是由于范德华力或氢键的作用,而筛选是由树脂本身的孔型结构所决定的. 根据树脂骨架材料的不同, 大孔树脂可以分为极性、弱极性和非极性三大类,吸附和筛选作用以及本身的极性使得大孔吸附树脂具有吸附、富集、分离不同母核结构化合物的功能[7,14]. 由于大孔吸附树脂的吸附饱和度会随着吸附物质的不同而不同, 因此对选用的吸附树脂进行静态吸附实验, 其结果如表4.

表4 树脂对甘草酸的静态吸附解吸附实验结果

在相同条件下大孔树脂的种类不同,其吸附、解吸能力不一样. 从吸附量和解吸率来看, 非极性的D-101型大孔树脂优于其它极性不同的树脂. 因此本课题选用D-101树脂来纯化甘草酸.

2.3.2 影响树脂对甘草酸动态吸附的因素

大孔树脂吸附甘草酸时, 存在着一个吸附动态平衡, 该平衡和料液浓度、吸附流速及料液pH值等存在很大的关系. 取粗品甘草酸分别配制成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL的溶液, 进行动态吸附实验.

料液浓度: 取上述浓度的甘草酸样品溶液通过装有D-101树脂的色谱柱, 调节pH值为6.0, 吸附流速为2BV/h. 结果表明, 若上样液较稀, 则甘草酸液粘度较小, 通过色谱柱时流速过快, 大于传质速度, 部分甘草酸在达到饱和之前未被吸附而漏掉; 若上样液浓度过高, 也会导致甘草酸吸附不完全. 上样液中甘草酸在6～8 mg/mL之间比较合适, 其树脂的吸附能力较强, 且吸附量随着浓度升高而增多.

吸附流速: 为了充分发挥树脂的吸附效能, 必须使液固两相有充分的接触时间, 如果物料流速太快,将使固液接触的时间缩短, 被吸附物提前流出色谱柱, 使柱效能降低. 通常吸附流速以慢速为好, 但不能太慢, 否则会造成柱内液相的纵向混返, 不利于树脂的吸附, 同时将延长生产周期, 从而提高成本. 综合考虑, 选择吸附流速为3 BV/h为宜.

料液pH值: 取7.0 mg/mL的溶液, 吸附流速控制为2BV/h, 分别设定pH值为4、5、6、7, 收集流出液并测量, 以TLC板标定终点, 计算吸附量. 当pH值在4～7之间时, 大孔树脂的吸附能力都比较好, pH为6.0左右时其吸附量达到最大值.

2.3.3 D-101型树脂洗脱液的选择对甘草酸动态解吸的影响

吸附树脂的解吸是通过改变体系的亲水-疏水平衡来调整控制, 改变原来的吸附条件, 让吸附质重新由树脂相进入溶液. 解吸剂(又称洗脱剂)以最能溶解吸附质为原则, 因此乙醇为常用解吸甘草酸的树脂洗脱液.

取3份7.0 mg/mL的甘草酸样品溶液通过D-101大孔树脂, 在上述实验条件下进行动态吸附. 再分别用20%、40%、60%的乙醇洗脱, 每通过1BV收集一份洗脱液, 用紫外分光光度法测量甘草酸含量. 结果显示, 3种不同浓度的乙醇对甘草酸洗脱效果基本相当, 其最高峰均出现在2BV前后. 当洗脱液体积达4BV时, 20%乙醇的洗脱液中甘草酸含量已经接近为零, 而40%、60%乙醇在此体积时未能洗脱完全, 说明它们的洗脱能力较20%的乙醇弱. 所以甘草酸的洗脱液选择以4BV和20%的乙醇为最佳条件.

3 结论

甘草酸粗品提取的最佳工艺条件: 氨水浓度(V/V)为0.5%, 乙醇浓度(V/V)为(40%), 提取时间2h, 甘草颗粒过2号筛, 提取温度为60℃、料液比为1:12, 1.5为酸沉pH值等, 在该条件下甘草酸的提取效率可达9.86%.在甘草酸的精制过程, 选择D-101型大孔树脂作为精制甘草酸的最佳树脂, 其吸附率和解吸率均较高; 其最佳的工艺条件为: 树脂量为100 mL, 上样液中甘草酸的浓度在6～8mg/mL之间, 料液pH值为6.0, 吸附流速为3 BV/h; 选用4 BV和20%的乙醇作为洗脱液; 解吸液浓缩经脱色后甘草酸纯度高达89.6%.

随着中药现代化、国际化和工业化的进程日益加快, 甘草酸在提取过程中要求快速、完全及高度纯化已成为必然. 因此微波、超声、超临界等现代提取技术及双水相萃取与高速逆流色谱等新型分离手段的应用也将成为甘草酸提取、精制方法发展的主流.

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Optimization on Extraction and Purification Technology of Glycyrrhizic Acid from Liquorice

SHE Jin-ming1,3, LIU You-shi2, XIE Xian-zhen3, LIANG Yi-zeng1
(1. Research Center of Modernization of Chinese Herbal Medicine, College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083 China; 2. College of Science and Technology, HNUT, Zhuzhou 412008, China; 3. Department of Pharmacy, Changde Vocational and Technical College, Changde 415000, China)

This research uses the ammonia and ethanol solution to extract Glycyrrhizic Acid from Liquorice. Taking the contents of Glycyrrhizic Acid as an index, and considering the result of impel factor test, it optimizes the extraction technology in terms of the temperature, rate of material-liquid and pH of acid precipitation and so on, by implementing the orthogonal experiment. The D-101 macroporous adsorption resin is selected by statical adsorption, the best optimum condition is obtained through dynamic adsorption and desorption experiment. And also, it provides the theoretic basis for the extraction and purification technology of Glycyrrhizic acid.

glycyrrhizic acid; Orthogonal experiment; extraction and purification; macroporous resin

R284.2

A

1672-5298(2010)03-0055-05

甘草(Radix Glycyrrhiza)一般指豆科植物乌拉尔甘草(Glycyrrhizae uralensis Fisch)、胀果甘草(Glycyrrhizae inflate Bat)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L)的干燥根及根茎[1]. 它主要分布在西北、华北、东北地区[2]. 甘草历来享有“中草药之王”的美誉, 具有广泛的生理活性. 主要用作抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫功能等作用[3]. 近年来临床上还用于治疗各种急慢性肝炎、肝纤维化、支气管炎和艾滋病等疾病[4～6].

甘草主要含有甘草酸(glycyrrhizic acid, 又称甘草甜素)、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等, 其中甘草酸是最重要的化学成分和活性组分, 其骨架为齐墩果烷型弱酸, 由于分子中含有多个羧基、羟基等极性基团, 它溶于热水和热的稀乙醇, 不溶于无水乙醇和乙醚. 实际上甘草酸在植物体中可能以钾盐或钙盐的形式存在, 通常甘草酸是指甘草酸及其盐的通称, 其含量在4～14%的范围内. 在提取过程中加入稀氨水能提高甘草酸的提取效率便是这个缘故, 因此甘草酸盐遇酸则生成沉淀, 所以利用此性质进行提取纯化[2,7].

目前甘草酸的提取与精制工艺研究较多. 但每种方法各有利弊. 如传统的水提取法效率太低, 且产品易于霉变; 单纯的氨提取法易造成污染; 而现代微波提取和超声提取不适宜工业化的生产[8,9]. 综合比较,氨性醇提取是一种比较实用的方法. 关于甘草酸的精制方法, 主要有超滤法、溶剂法(结晶法)、树脂法、聚酰胺法等[10], 工业生产中主要应用溶剂法, 但树脂法中的大孔树脂吸附法精制效果好. 本文以甘草酸的粗得率为指标, 结合单因素研究的结果, 运用正交实验法对提取温度、料液比, 酸沉pH值等因素进行工艺优化, 再通过静态吸附实验、动态吸附与解吸实验, 筛选出大孔吸附树脂和纯化方法的最佳工艺条件,为甘草酸的提取与精制提供依据.

2010-06-10

国家自然科学基金资助项目(20875104)

佘金明(1966- ), 男, 湖南桃源人, 硕士, 常德职业技术学院药学系副教授. 主要研究方向: 天然药物化学