东北矮紫杉人工种子的制备

孙 筱 筠， 张 宗 申

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

东北红豆杉又名紫杉，是国家Ⅰ级重点保护植物。近年来，人们从东北红豆杉根、茎、叶中分离出抗癌活性成分——紫杉醇[1-2]。研究表明：紫杉醇能与微管蛋白结合，并促进其聚合，抑制癌细胞的有丝分裂，阻止癌细胞的增殖，具有明显的抗白血病、肺癌、卵巢癌、乳腺癌的作用[3]。据分析，我国4个红豆杉品种中以东北红豆杉枝叶中所含的紫杉醇最高[4]。红豆杉属植物在自然条件下种子萌发率低，再加上属于雌雄异株，自然结种率低，种质资源少，种子休眠期长等原因繁殖速度慢[5]，因此通过自然种子繁殖红豆杉受到很大限制。与通过自然种子的繁殖方式相比，人工种子具有繁殖速度快、节省资金、人力和土地等优点，因此对于红豆杉属物种的保护和药用价值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

愈伤组织：取大连工业大学校园内种植的东北矮紫杉嫩茎，在mB5[6]培养基上诱导愈伤组织，每25天继代1次，(24±1)℃下黑暗培养，挑选乳白色、质地松散、表面呈颗粒状的愈伤组织作为繁殖体。

腋芽在大连地区4月份的矮紫杉枝条上采取。

1.2 方 法

1.2.1 用愈伤组织制作人工种子

包埋剂浓度的选择:将愈伤组织切成直径2～3 mm的小块，放入不同浓度的海藻酸钠溶液中(见表1，用mB5培养基配制)充分混合，浸泡3～4 min，然后用胶头滴管每次吸取1个繁殖体滴入2.5% CaCl2溶液中。形成的人工种子用无菌水冲洗3～4次，置于无菌纸上吸去人工种子表面水分。将制作好的人工种子置于铺有无菌水浸润滤纸的培养皿中，培养温度(24±1)℃，每天光照12 h，光照强度1 500～2 000 lx。观察人工种子形态并每5 d测量1次失水率，试验重复3次。

人工胚乳成分的配制：在mB5培养基配制的3.0%海藻酸钠溶液中，分别添加不同浓度的可溶性淀粉、草酸、水杨酸、低分子壳聚糖和高分子壳聚糖，然后用愈伤组织制备人工种子(CaCl2质量分数为2.5%)。观察人工种子形态并每5 d测量1次失水率，试验重复3次。

1.2.2 用腋芽制作人工种子

植物生长调节剂的优化：将剥取的腋芽用75%酒精处理30 s，再于0.1%升汞溶液中处理5 min，然后用无菌水冲洗3～5次。在包埋基质中添加不同种类及浓度的生长调节剂(包埋基质为3.0%海藻酸钠溶液，包含mB5培养基、3.0%蔗糖、1.5%可溶性淀粉、10-6mg/L水杨酸)，络合电解质为2.5% CaCl2。将制好的人工种子置于含有相应生长调节剂的mB5固体培养基上进行萌发，培养温度(24±1)℃，每天光照12 h，光照强度1 500～2 000 lx，30 d后统计人工种子萌发率。

2 结果与分析

2.1 包埋剂浓度对用愈伤组织制备的东北矮紫杉人工种子包埋效果及保水性的影响

不同浓度的海藻酸钠对人工种子形成的质量、形成时间和保水性都有影响。随着海藻酸钠浓度的升高，人工种子形成的时间缩短，保水性也越来越好。由表1和表2可以看出，海藻酸钠浓度过低，形成的人工种子的时间较长，颗粒不均，种子较软容易粘连；浓度过高，虽然形成的人工种子颗粒均一，但硬度大、不透明，会阻碍种子的萌发。只有3.0%海藻酸钠包埋制成的人工种子大小均匀，硬度适中，透明而富有弹性，所以3.0%海藻酸钠在2.5% CaCl2中反应8～10 min是制备人工种子的最佳条件(见图1a)。

表1 不同浓度包埋剂对人工种子质量、形成时间的影响Tab.1 The effects of different concentration on encapsulation formulation of artificial seeds

表2 不同浓度包埋剂包埋人工种子的失水情况(24 ℃)Tab.2 The effects of embedding agent concentration on the water loss of artificial seeds (24 ℃)

a, 3.0%海藻酸钠+2.5%CaCl2制成的人工种子; b, 萌发前的人工种子; c, 萌发后的人工种子

2.2 添加可溶性淀粉、诱导子对用愈伤组织制备的人工种子包埋效果及保水性的影响

在包埋基质中添加可溶性淀粉、草酸、水杨酸和壳聚糖对人工种子保水性均有较大影响。如表3所示，添加可溶性淀粉可以提高种子的保水性，其中添加1.5%可溶性淀粉的失水率最低，储藏15 d后失水率为25.29%。这可能与可溶性淀粉的多孔结构能够增加对水分的吸附作用、从而导致水分散失缓慢有关；但是可溶性淀粉含量越高，制备出来的种子黏性也越大，种子之间更容易粘连，并且黏度越大，种子的透气性相对也越差，这些因素对种子的萌发会有一定的抑制作用。添加草酸和水杨酸对人工种子保水性差别不大，均在24%～35%，且硬度适中对种子形成时间及形态影响较小。其中，以添加10-6mg/L水杨酸的种子颗粒最均一，色泽最好。在包埋基质中添加的壳聚糖浓度越高，种子形成的时间越短，保水性也越好。但是添加壳聚糖形成的种子虽然颗粒均一，但颜色暗黄，硬度过大，可能影响种子萌发。

在制备人工种子的过程中，在胚乳中添加可溶性淀粉和诱导子可以改善人工种子的保水性，从而提高了人工种子的保存时间。但从上述结果分析，在添加可溶性淀粉和诱导子的时候，要综合考虑其对种子质量的影响，选择适宜的添加浓度是关键。

表3 可溶性淀粉、草酸、水杨酸、壳聚糖对东北矮紫杉人工种子的保水效果(24 ℃)Tab.3 The effects of soluble starch, oxalate acid, salicylic acid and chitosan on the water retenation of artificial seeds (24 ℃)

2.3 添加植物生长调节剂对用腋芽制备的矮紫杉人工种子萌发的影响

在胚乳中单独添加NAA对矮紫杉人工种子的萌发有较大的促进作用。由表4可以看出，在一定浓度范围内，随着NAA浓度增加，种子萌发率上升，以1.5 mg/L NAA的促进效果最好，培养30 d 后萌发率达到了38.1%；然而，随着6-BA浓度的增加，人工种子的萌发率呈下降趋势。

表4 植物生长调节剂对矮紫杉人工种子萌发率的影响Tab.4 The effects of plant growth regulator on the germination rate of artifical seeds of Taxus cuspidata CV.Nana

由表4可以看出，与单独添加NAA和6-BA相比，同时添加NAA和6-BA对东北矮紫杉人工种子的萌发有一定的抑制作用，而不添加任何激素的人工种子也能萌发，这可能是因为东北矮紫杉的腋芽本身带有的激素浓度可以保证其萌发的需要，但萌发率并不高。

3 讨 论

海藻酸钠凝胶包埋系统具有无毒且价格低廉、工艺简单等优点，因此本试验采用海藻酸钠作为东北矮紫杉人工种子的包埋系统。试验得出东北矮紫杉人工种子的最佳制作条件为3%海藻酸钠在2.5% CaCl2中反应8～10 min。然而从试验中可以看出海藻酸钠包埋系统保水性较差，至使水溶性养分很快浸出，另外制成的人工种子只能短期储存，在萌发出芽时常常受阻。故今后的研究应寻找更适合于人工种子实际应用的固形包埋基质。

黄绍兴等[7]将木薯淀粉加入到海藻酸钠凝胶系统中制成复合包埋基质，结果发现改善了由单一海藻酸钠凝胶系统制作的人工种子胚乳的吸水性，从而提高了人工种子的发芽率。本试验在人工胚乳中添加可溶性淀粉对人工种子的保水性和质量起到了促进的作用，但浓度是关键因子，太高会影响种子的物理性质，如黏度等，对人工种子的萌发会有一定的影响。

李烜赫等[8]在诱导子对红豆杉培养细胞紫杉醇产量的影响研究中发现，生物或非生物诱导子可诱导红豆杉细胞产生抗逆反应，启动次生代谢途径，从而导到紫杉醇的大量合成。草酸和水杨酸作为诱导子添加到人工种子中对人工种子质量影响效果不大，但提高了种子的保水性和形态，其中以10-6mg/L水杨酸的效果最好，人工种子颗粒最均一，成色最好，且浓度低，可节约制作成本。

高分子壳聚糖和低分子壳聚糖对人工种子的保水性和成形时间及颜色都有显著的影响。含量越高保水性越好，同时成形时间越短，但种子硬度很大，颜色很深，对人工种子的萌发会有一定的抑制作用。因此，今后对人工胚乳添加成分上还要作进一步的研究，以便对人工种子进行更好的储藏。

在人工胚乳中加入NAA有利于人工种子的萌发，以1.5 mg/L NAA对人工种子萌发促进效果最为显著，萌发率达到了38.1%，而6-BA则有一定的抑制作用。虽然本实验中人工种子能够萌发，但萌发率并不高。因此，今后需要对提高东北矮紫杉人工种子萌发率的技术继续研究。

[1] 李伯林,赵群华. 红豆杉植物愈伤组织的培养及紫杉醇形成初探[J]. 南京大学学报, 1995, 31(3):55-58.

[2] 吴晓庆. 抗肿瘤新药紫杉醇研究进展[J]. 中国生化药物杂志, 1996, 17(3):13l-l35.

[3] 陈庆红,陈庆瑛,黄利亚,等. 东北红豆杉开发研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2005, 24(1):41-42.

[4] 车熙哲,赵传彦,赵海涛. 东北红豆杉的发展前景与效益分析[J]. 特种经济动植物, 2004(5):26-27.

[5] 陈庆红,陈庆瑛,黄利亚,等. 东北红豆杉开发研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2005, 24(1):41-42.

[6] LEE B S, SON S H. A method for the producing taxol and taxanes from embryo cultures of Taxus species:Europe, WO 9502063[P]. 1995-07-12[2009-10-09]. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=KR1994000088&DISPLAY=DESC.

[7] 黄绍兴,黄美娟,朱澂. 木薯淀粉对人工胚乳性能及对人工种子发芽率的影响[J]. 生物工程学报, 1995, 11(1):39-44.

[8] 李烜赫,杨坤. 诱导子对红豆杉培养细胞紫杉醇产量的影响[J]. 生物学通报, 2006, 41(6):55-57.