采油菌株Bacillus FH-1-2的培养特性研究

王 建 伟， 孙 玉 梅， 曹 芳， 王 培 忠

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

石油是一种不可再生能源，通过一次、二次采油后仍然有约60%的石油残留在井下。微生物采油技术(MEOR)是利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率的一种综合性采油技术，与传统的三次采油技术相比，具有适用范围广、工艺简单、经济效益好的优势，具有良好的发展前景[1-2]。

采油微生物的培养特性与其采油应用效果具有紧密的联系。采用14C标记的正十六烷作为铜绿假单胞菌PG201、UO299生长基质，发现菌株所产鼠李糖脂有助于提高正十六烷在培养基中的溶解性，并且能够提高细胞表面疏水性，细胞和烷烃的液滴直接接触和假溶作用将烷烃转运到微生物细胞中[3]。通过Pseudomonasfluorescens利用砂岩管进行穿越多孔介质的实验，发现处于饥饿状态的菌体细胞比营养状态良好的菌体细胞的流动能力、穿越能力更强，并且表现出规律性更强的吸附性能[4]。

本文以发酵液的表面张力、pH值和菌体密度以及细胞疏水性为衡量指标，研究采油微生物BacillusFH-1-2菌株的培养特性，为采油微生物的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌 种

BacillusFH-1-2由辽河油田丰华应用技术综合厂提供。

1.2 试 剂

试剂均为国产分析纯和化学纯试剂。

1.3 培养基

斜面培养基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏5，蛋白胨10，琼脂20，pH 7.0。

LB种子培养基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏5，蛋白胨10，pH 7.0。

发酵液培养基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液蜡25 mL/L，pH 7.0[5]。

以上培养基均在1.03×105Pa蒸汽灭菌20 min。

1.4 菌体培养

1.4.1 菌种保存及活化

BacillusFH-1-2菌株在4 ℃保存于斜面培养基。取4 ℃保存的菌种，接种于斜面培养基，于30 ℃活化培养36 h。

1.4.2 种子液制备

取斜面活化的菌种培养物2环菌体接入100 mL种子培养基中(250 mL三角瓶)，于30 ℃、150 r/min摇床培养24 h。

1.4.3 发酵液制备

于100 mL发酵培养基中(250 mL三角瓶) 接种5%种子培养液。用棉塞封口，于30 ℃、150 r/min摇床振荡培养，实现好氧发酵。用聚乙烯保鲜膜封口，于30 ℃静置培养，实现兼性厌氧发酵。

1.5 检测方法

1.5.1 菌体密度测定

采用比浊法于600 nm测定菌体密度[6]。移除发酵液上层油相，除油后的发酵液漩涡振荡，取3 mL发酵液加入TritonX-100 (0.2%)溶液0.5 mL漩涡振荡1 min，于3 000g离心15 min，倒掉上清液，用去离子水洗涤菌体2次，再用3 mL去离子水重悬菌体，去离子水为空白测定OD600。

1.5.2 细胞疏水性测定

采用BATH法于600 nm测定细胞疏水性[7]。移除发酵液上层油相，除油后的发酵液漩涡振荡1 min，取3 mL发酵液，去离子水做空白，测定OD600值，然后加入0.1 mL石油醚，振荡1 min，静置30 s，再振荡1 min，于30 ℃水浴静置15 min，注射器取下层菌液测定BATH OD600。用BATH OD600/OD600表示细胞疏水性。

1.5.3 表面张力测定

采用表面张力仪(承德大华试验机有限公司)测定发酵液上清液表面张力。将发酵液用中速定性滤纸过滤除油，滤液于3 000g离心15 min除菌，上清液待测。

1.5.4 pH测定

采用PH3-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)测定。

本研究所有实验结果均通过3次平行实验获得。

2 结果与讨论

2.1 好氧条件下的菌体培养特性

在好氧条件下培养BacillusFH-1-2，培养过程中的细胞疏水性、菌体密度以及培养液的表面张力和pH值的变化如图1所示。

图1 好氧条件下Bacillus FH-1-2的培养过程曲线Fig.1 Course curve for cultivating Bacillus FH-1-2 under aerobic condition

由图1可见，在好氧培养BacillusFH-1-2的前24 h，菌体密度急剧上升，在培养的24～36 h，菌体密度上升速度减缓。培养36 h后，细胞进入了生长稳定期。在培养84～108 h时的菌体达到最大生长，108 h后进入衰亡期。值得注意的是，在84～120 h菌体生长与发酵液表面张力呈正相关，反之亦然。

在培养96 h前，培养液pH值缓慢上升，然后下降。发酵液pH降低是菌体将液体石蜡氧化成脂肪酸的结果[8]。

细胞疏水性是菌体接触和吸收利用烃基质的前提和保证[9]。表面活性剂通过调节细胞表面的疏水性影响微生物细胞与烃类之间的亲和力。BacillusFH-1-2在培养过程中表现出一定的细胞疏水性，为菌体生长提供了保障，菌体生长较稳定。

在培养的前12 h培养液表面张力快速较大幅度下降，说明BacillusFH-1-2很快利用烷烃代谢产生表面活性物质。在培养12 h后，培养液表面张力有所上升，随后变化幅度较小。表面活性物质浓度变化会导致发酵液的表面张力发生变化，两者具有良好的线性关系[10]。在培养108 h后菌体进入衰亡期，此时发酵液表面张力明显下降。表面活性物质多为胞外产物或附着于细胞外[11]，当细胞自溶时，附着于细胞外的表面活性物质转移到发酵液中，使培养液表面张力产生较大幅度的下降[12]。

2.2 兼性厌氧条件下的菌体培养特性

在兼性厌氧条件下培养BacillusFH-1-2，培养过程中的细胞疏水性、菌体密度以及培养液的表面张力和pH值的变化如图2所示。

图2 兼性厌氧条件下Bacillus FH-1-2的培养过程曲线Fig.2 Course curve for cultivating Bacillus FH-1-2 under facultative anaerobic condition

由图2可知，在兼性厌氧培养BacillusFH-1-2的前48 h，细胞生长状态与好氧培养相似，培养48 h后菌体生长进入稳定期，与好氧发酵不同的是在培养96 h后细胞进入二次生长期。培养过程中的发酵液pH变化与好氧发酵相似，说明溶氧量对发酵液pH变化没有显著影响。好氧和兼性厌氧条件下培养的细胞疏水性变化趋势相近，但兼性厌氧培养生长较慢，在培养120 h时细胞生长接近最大且细胞疏水性略有升高，这说明细胞疏水性对菌体生长具有促进的作用。

在兼性培养BacillusFH-1-2的过程中，表面张力和菌体生长联系紧密。在对数生长期表面张力随着细胞密度的增大而下降。在稳定生长期发酵液的表面张力出现振荡状态，表面张力随着菌体密度的增大而升高，细胞利用表面活性物质或生物表面活性物质的前体进行二次生长，而后表面张力随菌体密度下降而迅速下降。

2.3 好氧和兼性厌氧培养条件下的培养特性比较

由图3可见，在好氧和兼性厌氧培养条件下，菌体生长趋势相似，好氧培养菌体生长更加旺盛，其衰亡也较快，而兼性厌氧培养的菌体生长平稳，稳定期长。两种培养条件下的发酵液表面张力变化趋势相近，但是兼性厌氧条件下发酵液的表面张力下降更多，更有利于原油采收。

图3 好氧和兼性厌氧条件下菌体生长和发酵液表面张力Fig.3 Course curve for cell growth and surface tension of fermenting broth under aerobic and facultative anaerobic condition

由图4可知，在好氧和兼性厌氧条件下，发酵液的pH变化趋势基本一致，由此推测在培养过程中，溶氧量对pH变化影响不显著，兼性厌氧条件下的菌体生长较慢致使pH变化较慢。在发酵前期好氧比兼性厌氧条件下的细胞疏水性低，而后期却升高很快。两种条件下的细胞疏水性的变化趋势相似，兼性厌氧比好氧条件下的细胞疏水性的变化滞后约60 h，其原因在于高溶氧量有利于菌体的生长代谢。

在摇床上进行的好氧发酵比在静置状态下进行的兼性厌氧发酵的分子运动及细胞的传质效果要好，以及二者溶解氧的差别，使好氧发酵和兼性厌氧发酵产生如上诸多差别。

图4 好氧和兼性厌氧条件下的细胞疏水性和发酵液pHFig.4 Course curve for hydrophobic property of cell and pH of fermenting broth under aerobic and facultative anaerobic condition

3 讨 论

采油菌株BacillusFH-1-2在好氧和兼性厌氧培养过程中培养液的菌体密度、表面张力和pH值以及细胞疏水性均表现出变化且各参数相互影响。好氧和兼性厌氧发酵的参数变化趋势非常相近，兼性厌氧发酵的参数变化较慢。在整个发酵过程中细胞疏水性和发酵液pH值均无显著变化，发酵液接近中性，有利于菌体生长，细胞疏水性保证了细胞与烃类基质的接触和摄入。在不同生长时期，菌体密度和发酵液表面张力具有不同的关系，即在对数生长期发酵液表面张力随菌体密度增加而降低，稳定期和衰亡期发酵液表面张力和菌体密度正相关。兼性厌氧培养更有利于菌株BacillusFH-1-2应用于原油采收。

[1] 张雪梅,佘跃惠,黄金凤,等. 大庆油田聚合物驱后油藏微生物多样性研究[J]. 应用与环境生物学报, 2008, 14(5):668-672.

[2] SONG Shaofu, ZHANG Zhongzhi, LI Shuyuan. Progress of microbial enhanced oil recovery in laboratory investigation[J]. Petroleum Science, 2004, 1(4):23-30.

[3] BEAL R, BETTS W B. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and mineralization of hexadecane inPseudomonasaeruginosa[J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 89:158-168.

[4] CUNNINGHAM A B, SHARP R R, CACCAVO J F, et al. Effects of starvation on bacterial transport through porous media[J]. Advances in Water Resources, 2007, 30:1583-1592.

[5] 侯百友,孙玉梅,杨冠科,等. 烃降解菌HB29产糖脂发酵条件的研究[J]. 中国酿造, 2009(2):83-85.

[6] 陈延君,王红旗,王然,等. 鼠李糖脂对微生物降解正十六烷以及细胞表面性质的影响[J]. 环境科学, 2007, 28(9):2117-2122.

[7] 刘晔,周卫民,牟伯中,等. 长链烷烃降解菌的降解特性[J]. 微生物学杂志, 2005, 25(6):14-18.

[8] 严复,彭志英,郭勇,等. 生物化学[M]. 北京:轻工业出版社, 1980.

[9] 张明露,马挺,李国强,等. 一株耐热石油烃降解菌的细胞疏水性及乳化﹑润湿作用研究[J]. 微生物学通报, 2008, 35(9):1348-1352.

[10] 张凡,佘跃惠. 排油圈法对生物表面活性剂的定性与定量[J]. 化学工程师, 2005(1):14-18.

[11] BICCA F C, FLECK L C, AYUB M A Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degradingRhodococcusruberandRhodococcuserythropolis[J]. Revista de Microbiologia, 1999, 30:231-236.

[12] 李清心. 鼠李糖脂合成酶Rh1A和Rh1B基因的克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究[D]. 济南:山东大学, 2005.