碘量法测定发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

冯晓燕，周延政，孙文敬,，王大明，余泗莲，刘敬泽,*

(1.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；3.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221)

碘量法测定发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

冯晓燕1，周延政2，孙文敬1,2，王大明1，余泗莲3，刘敬泽1,*

(1.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；3.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221)

在优化样品处理条件的基础上，考察葡萄糖对2-酮基-D-葡萄糖酸测定的影响，改进发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的碘量法测定技术。结果表明：滴定样品溶液所消耗的I2标准溶液的体积、样品溶液中2-酮基-D-葡萄糖酸质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系，R2＞0.9999；该方法精密度、稳定性和重现性良好，2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率为95.68%，RSD为1.35%(n=5)。该方法准确、快速，操作简便，可用于发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量检测。

2-酮基-D-葡萄糖酸；葡萄糖；发酵液；碘量法

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是目前国际上规模化发酵生产的有机酸之一，主要作为食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其盐类合成的前体[1-4]。关于发酵液中2KGA的测定方法已有一些报道，如旋光法[5]、酸碱滴定法[6]、HPLC法[1]、酶法[7]和碘量法[8-9]等。旋光法、HPLC法和酶法等仪器分析方法可以准确检测发酵液中的2KGA，但因样品处理过程复杂、所需仪器昂贵或试剂成本较高等原因而难以在国内工业生产中得到推广应用；酸碱滴定法的操作过程比较简单，但因测定中的变色现象难以观察而导致检测结果误差较大。因此，碘量法成为目前国内工业生产上检测发酵液中2KGA的主要方法。

碘量法测定2KGA的基本原理：2KGA分子内含有可直接发生酯化反应的羧基和醇羟基，还含有可发生互变异构反应的羰基，在强酸性条件下加热2KGA水溶液可以将其定量转化为D-异抗坏血酸[10]。利用D-异抗坏血酸与I2的氧化还原反应可以定量测定D-异抗坏血酸的质量浓度[11-12]，然后换算成2KGA的质量浓度。该方法也称转化碘量法[13]。

长期以来，国内相关学者对发酵液中2KGA碘量法测定的准确性还有一些质疑。有学者认为，发酵液中的葡萄糖对该法的测定结果影响很大[6]。因此，本研究对发酵液中2KGA的碘量法测定进行方法学考察，为该方法在生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2KGA发酵液：采用文献[4]的菌种和方法自制；2KGA钙盐(2KGA含量的质量分数为78.41%) 江西省德兴市百勤异V C钠有限公司；葡萄糖、碘、碘化钾、硫酸、氢氧化钠、可溶性淀粉等为国产分析纯试剂；实验溶液均采用二次蒸馏水配制。

1.2 仪器与设备

SBA-40型生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；PHS-3C型pH计 上海精密仪器有限公司；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；80-2型离心沉淀机 巩义市予华仪器有限责任公司；CS501型超级恒温水浴器 常州诺基仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的制备

取一定量的发酵液，4000r/min离心20min除去沉淀物。取1.0mL上清液于试管内，与5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液充分混合，立刻将试管放入沸水浴中精确加热35min。从水浴中取出试管后，立即用冷水将其冷却，再用100mL蒸馏水将试管内的反应液洗入250mL三角瓶中，所得的混合液作为样品溶液。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取各配比所需的无水葡萄糖和2KGA，用少量水将其充分溶解，加入100mL的容量瓶中定容。其他制备步骤同1.3.1节，所得的溶液作为对照品溶液1～9。

1.3.3 碘标准溶液的配制及标定

按文献[14]方法进行配制和标定。

1.3.4 葡萄糖的分析

25℃条件下，采用生物传感分析仪测定。

1.3.5 pH值的测定

采用pH计测定。

1.3.6 2KGA的测定

以1g/100mL的淀粉溶液为指示剂，用0.05mol/L的I2标准溶液滴定待测溶液至蓝色，30s内溶液不褪色即为滴定终点，记录滴定消耗的I2标准溶液的体积。待测溶液中2KGA的质量浓度X1与I2标准溶液消耗量Y之间存在如下关系：

式中：X1为待测样品溶液中2KGA的质量浓度/(mg/ mL)；Y为滴定待测样品溶液时消耗的0.05mol/L I2标准溶液体积/mL；4.403为1.0mL 0.05mol/L I2标准溶液相当于D-异抗坏血酸的毫克数[15-16]；A为测定条件下2KGA转化为D-异抗坏血酸的转化率；B为待测样品溶液的取样体积/mL；0.9071为D-异抗坏血酸与2KGA的相对分子质量之比。

1.3.7 2KGA转化为D-异抗坏血酸的转化率测定

以特定条件对2KGA标准品进行转化，然后采用1.3.6节的方法测定反应液消耗I2标准溶液的体积。2KGA转化为D-异抗坏血酸的转化率(A)：

式中：V为滴定反应液时消耗的0.05mol/L I2标准溶液体积/mL；4.403为1.0mL 0.05mol/L I2标准溶液相当于D-异抗坏血酸的毫克数[15-16]；m为被测标准品溶液中2KGA的质量/mg；0.9071为D-异抗坏血酸与2KGA的相对分子质量之比。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的优化

2.1.1 H2SO4用量的选择

在水浴温度100℃、加热时间20min、H2SO4浓度2.0mol/L的条件下，对1.0mL质量浓度为2.0g/100mL的2KGA溶液进行转化，考察H2SO4用量对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响。研究结果(表1)表明，H2SO4用量为5.0mL时，2KGA转化为D-异抗坏血酸的转化率最高。因此，选择5.0mL的H2SO4用量作为2KGA样品溶液的处理条件之一。

表1 H2SO4用量对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响Table 1 Effect of H2SO4 concentration on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

2.1.2 水浴温度的选择

表2 温度对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响Table 2 Effects of temperature on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

在加热时间为20min、被测样品中加入5.0mL 2.0mol/L的H2SO4的条件下，对1.0mL质量浓度为2.0g/100mL的2KGA溶液进行转化，考察温度对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响。结果(表2)表明，转化率随水浴温度的升高而提高；温度达到100℃时，转化率有明显的增加。因此，选择100℃作为2KGA样品溶液的处理温度。

2.1.3 水浴时间的选择

在水浴温度100℃、被测样品加入5.0mL 2.0mol/L H2SO4溶液的条件下，对1.0mL质量浓度2.0g/100mL 2KGA溶液进行转化，考察水浴时间对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响(表3)。随着水浴时间的增加，2KGA转化为D-异抗坏血酸的转化率呈增加趋势，但反应液的色泽也会逐渐加深。反应时间超过35min时，转化率的增加不再明显(反应接近平衡)，反应液的色泽明显变深。有学者认为，反应时间过长，会导致具有烯醇结构的副产物产生，且该副产物同样具有较强的还原性，会影响测定结果[10]。综合考虑，该反应的水浴时间以35min为宜，以避免过多副产物的产生。

表3 水浴时间对2KGA转化为D-异抗坏血酸的影响Table 3 Effects of water bath treatment time on the conversion reaction of 2KGA to D-isoascorbic acid

2.2 方法学考察

2.2.1 葡萄糖存在条件下碘量法测定2KGA的准确性

根据2.1节研究结果可知，当待测样品中没有葡萄糖存在时，在优化的样品处理条件下(即1.3.1节样品溶液的制备条件)，待测样品I2标准溶液的消耗量Y与其2KGA质量浓度X1之间存在的线性关系为Y= 0.0630004X1。该情况下碘量法测定的准确性已经得到实践验证和相关学者的普遍认可，在此不再进行赘述。

按照国内现行的测定方法，对对照品溶液中的2KGA质量浓度进行测定。实验结果(表4)表明，葡萄糖对碘量法测定2KGA具有一定的影响，导致测定结果偏高。在实验设计的范围内，其相对误差最高可达6.82%。利用Excel对对照品溶液I2标准溶液的消耗结果(表4)进行多元线性回归，可以得到线性回归方程：Y=0.064060X1+0.000827X2，且R2＞0.9999。其中：Y为发酵液消耗碘液的体积(碘量值)/mL；X1为发酵液中2KGA的质量浓度/(mg/mL)；X2为被测样品中葡萄糖的质量浓度/(mg/mL)。

上述线性回归方程的建立，说明滴定对照品溶液的I2标准溶液消耗量、2KGA质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系，即葡萄糖对碘量法测定2KGA的影响可以从方法学上予以解决。实验结果(表4)表明，利用所建立的线性回归方程计算对照品溶液中2KGA的质量浓度，其相对误差明显降低。

表4 对照品溶液的组成及其碘量值测定结果Table 4 Composition and the iodine value of the standard solution

2.2.2 精密度实验

随机抽取对照品溶液5进行精密度实验(表5)。重复5次取样测定的碘量值及葡萄糖质量浓度的RSD值分别为0.49%和1.33%，根据线性回归方程计算的2KGA质量浓度的RSD值为0.48%，说明该方法具有良好的精密度。

表5 碘量法测定2KGA的精密度实验结果Table 5 Precisions of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.3 稳定性实验

取新鲜的发酵液，4000r/min离心10min。将离心得到的上清液在25℃条件下分别放置0、30、60、90min和120min，再按照1.3.1节的方法对其进行处理，然后测定样品溶液的碘量值及葡萄糖质量浓度，RSD值分别为0.79%和0.39%；根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中2KGA的质量浓度，RSD值为0.79%。结果(表6)表明，在本实验条件下，用于2KGA质量浓度测定的样品在2h内稳定。

表6 碘量法测定2KGA的稳定性实验结果Table 6 Stability of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.4 重现性实验

取相同的发酵液5份，按1.3.1节方法分别进行处理，测定所得各个样品溶液的碘量值及葡萄糖质量浓度，RSD值分别为0.55%和0.39%；根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中2KGA的质量浓度，RSD值为0.55%，结果(表7)表明重现性良好。

表7 碘量法测定2KGA的重现性实验结果Table 7 Reproducibility of the iodometry for determining 2KGA content in the fermentation broth

2.2.5 回收率实验

准确量取2KGA质量浓度36.6664mg/mL的发酵液50mL，精确加入0.6377g 2KGA钙盐(含2KGA 0.5000g)，按1.3.1节方法制备样品溶液，平行5份。测定各个样品溶液的碘量值及葡萄糖的质量浓度，并根据所建立的线性回归方程计算样品溶液中2KGA的质量浓度。计算结果(表8)显示，2KGA的5次平均回收率为95.68%，RSD为1.35%。

表8 2KGA的加标回收率和相对标准偏差Table 8 Spike recoveries and RSD for determining 2KGA content in the fermentation broth

3 结 论

实验结果表明，样品处理的适宜条件为2.0mol/L硫酸用量5.0mL，处理温度100℃，处理时间35min。在葡萄糖存在的条件下，滴定样品溶液的I2标准溶液消耗量、样品溶液中2KGA质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系，即葡萄糖对碘量法测定2KGA的影响可以从方法学上予以解决。2KGA碘量法测定技术的准确度较高，精密度、稳定性和重现性良好，操作简便、经济、快速，适用于2KG A发酵过程的控制分析。

[1] CHIA M, NGUYEN T B V, CHOI W J. DO-stat fed-batch production of 2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78: 759-765.

[2] 孙文敬, 魏转, 林琳, 等. 高浓度发酵及膜分离技术在2-酮基-D-葡萄糖酸生产中的应用研究[J]. 食品科学, 2009, 30(17): 244-246.

[3] 孙文敬, 杨庆文, 赵峰梅, 等. 2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46抗噬菌体菌株的选育[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 67-70.

[4] 孙文敬, 赵峰梅, 杨庆文, 等. 补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(11): 115-117.

[5] STUBBS J J, LOCKWOOD L B, ROE E T, et al. Bacterial production of ketogluconic acids from glucose[J]. Ind Eng Chem, 1940, 32: 1626-1631.

[6] 钱俊青. 间接发酵法生产异维生素C钠的中间体分析方法的探讨[J].食品工业, 1996(1): 54-56.

[7] SAICHANA I, ANO Y, ADACHI O, et al. Preparation of enzymes required for enzymatic quantification of 5-keto-D-gluconate and 2-keto-D-gluconate[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71: 2478-2486.

[8] 宋萍. 食品抗氧保鲜剂异VC钠研究及应用(扩试) 2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌优良新菌株选育试验报告[J]. 四川食品与发酵, 1998(1/ 2): 58-62.

[9] 孙文敬, 陈丽, 任蓓蕾, 等. 荧光假单胞菌AR4在2-酮基-D-葡萄糖酸工业生产中的应用研究[J]. 食品科学, 2006, 27(11): 105-108.

[10] 郑大贵, 叶红德, 余泗莲, 等. 由2-酮基-D-葡萄糖酸直接合成异VC的研究[J]. 食品工业科技, 2004, 25(7): 115-117.

[11] 宾祖焕, 黄若干, 梁峰, 等. 碘量法测定维C银翘颗粒中维生素C的含量[J]. 广西医学, 2003, 25(7): 1138-1141.

[12] 谢萍. 补料分批发酵工艺在维生素C二步发酵中的应用研究[D]. 天津: 天津大学, 2004.

[13] 梁改芹, 曹桂芳, 尹光琳. 食品抗氧化剂: D-异抗坏血酸的研究Ⅰ 2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛选和发酵产物的鉴定[J]. 微生物学通报, 1987, 14(6): 246-249.

[14] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 601—2002 化学试剂标准滴定溶液的制备[S]. 北京: 中国标准出版社, 2002.

[15] 国家发展和改革委员会. QB 2840—2007 食品添加剂 异抗坏血酸[S]. 北京: 中国轻工业出版社, 2007.

[16] 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB 22558—2008食品添加剂D-异抗坏血酸[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

Iodometric Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth

FENG Xiao-yan1，ZHOU Yan-zheng2，SUN Wen-jing1,2，WANG Da-ming1，YU Si-lian3，LIU Jing-ze1,*
(1. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China；2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

Iodometric method was improved to prevent the interference of glucose in determination of 2-keto-D-gluconic acid (2KGA) in fermentation broth. The results revealed a good linear relationship among the volumes of I2 standard solution consumed and concentrations of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2＞0.9999). The average recovery was 95.68% with the relative standard deviation (RSD) of 1.35% (n=5). The method developed here had good accuracy, stability and reproducibility, and was easily operated, hereby could be used for the determination of concentrations of 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

2-keto-D-gluconic acid；glucose；fermentation broth；iodometry

TQ921.2

A

1002-6630(2010)24-0314-04

2010-08-29

江苏大学科研启动基金项目(08JDG029)；江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(2008DD00600)；江西省科技支撑计划项目(赣财教[2008]147号)

冯晓燕(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为微生物生态学。E-mail：xiaoyan0316@126.com

*通信作者：刘敬泽(1964—)，男，教授，博士，研究方向为生态学。E-mail：liujingze@mail.hebtu.edu.cn