黑果枸杞叶总黄酮的体外抗氧化活性研究

李 进，李淑珍，冯文娟，原 慧

(1.新疆师范大学生命科学与化学学院，新疆珍稀濒危物种保护生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

黑果枸杞叶总黄酮的体外抗氧化活性研究

李 进，李淑珍，冯文娟，原 慧

(1.新疆师范大学生命科学与化学学院，新疆珍稀濒危物种保护生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

通过测定黑果枸杞叶总黄酮的还原能力，以及对小鼠血清羟自由基清除能力、小鼠红细胞溶血性、小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响，探讨黑果枸杞总黄酮的体外抗氧化活性。结果表明：黑果枸杞总黄酮在化学本质上具有一定的抗氧化能力，能显著抑制小鼠红细胞溶血，IC50为0.124mg/mL；能增强小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成，并显示出一定的量效关系。说明黑果枸杞叶总黄酮在一定浓度范围内具有抗氧化活性。

黑果枸杞叶；总黄酮；抗氧化；体外

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)是茄科枸杞属的多年生耐盐、抗旱灌木，分布于我国西北地区，是民族医药中的常用药材，藏医以其成熟的果实入药，治疗心热病、心脏病等病症[1]；而维吾尔医常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症，民间作滋补强壮以及降压药[2]。目前对于黑果枸杞的研究多集中于其果实所含色素和多糖的提取和生物活性方面[3-6]，而对其叶片中黄酮物质的研究未见报道。因此，本实验探讨黑果枸杞叶片中总黄酮在体外生物模拟体系中的抗氧化活性，以为中药数据库的建立提供信息资料，同时也为其作为抗氧化药物或食品抗氧化剂开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本实验所用材料为黑果枸杞的叶片，采自新疆石河子144团，材料经过粉碎后，过35目筛，置于干燥器中备用。

所用试剂均为分析纯级。

2800UV型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；FA 1104N电子天平 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；DHG-9070A型电热恒温干燥箱 上海第三分析仪器厂；RE-52旋转真空蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-82 型水浴恒温振荡器 江苏太仓医疗器械厂；HL-2S恒流泵 上海康华生化仪器制造厂；TDL-60B离心机 上海安亭科学仪器厂；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；玻璃组织匀浆器等。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞叶总黄酮的制备

取经过脱脂处理的黑果枸杞叶片粉末，用20倍量60%乙醇溶液在60℃浸提40min，抽滤，得到澄清提取液，减压浓缩回收乙醇，得到无乙醇味的浓缩液，经水适当稀释后，流经AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，再用95%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，真空干燥即得淡黄色总黄酮粉未[7]。

1.2.2 黑果枸杞叶总黄酮还原力的测定

取2.5mL样品(质量浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)于试管中，依次加入2.5mL的0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 6.6)和2.5mL的质量分数1%六氰合铁酸钾溶液(K3Fe(CN)6)，于50℃水浴保温20min后，快速冷却，再加入2.5mL的质量分数10%三氯乙酸溶液(TCA)，以3000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入4mL蒸馏水，1mL的质量分数0.1%三氯化铁溶液(FeCl3)，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度A700nm(以蒸馏水做参比液)，吸光度越大表示还原能力越强[6]。

1.2.3 黑果枸杞叶总黄酮对小鼠血清羟自由基清除能力的影响

分别取0.1mL小鼠血清用含有不同质量浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)黄酮样品的生理盐水稀释20倍，于37℃温浴1h后，吸取0.2mL直接按照羟自由基测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)方法测定A550nm，计算羟自由基清除能力。并以反应体系中样品浓度作对体系的羟自由基清除能力的变化曲线[6,8]。

1.2.4 黑果枸杞叶总黄酮对红细胞保护作用

小鼠眼眶取血，肝素抗凝全血，用生理盐水2000r/min 15min离心洗涤3次，去除血浆后，以生理盐水配制质量分数0.5%的红细胞悬液，4℃保存备用。

取1mL质量分数0.5%的红细胞悬液，加入0.1mL不同质量浓度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)的样品溶液，混匀后，再加入0.1mL 100mmoL/L H2O2，37℃下保温1h，然后用4mL生理盐水稀释，2000r/min离心5min，取上清液测415nm处的吸光度(A1)。空白管以0.1mL 生理盐水代替样品液，其余操作同样品管，测得空白管吸光度(A0)[9-10]。

样品对红细胞溶血的半抑制量(IC50)是指对红细胞溶血抑制率达到50%时的样品质量浓度。

1.2.5 黑果枸杞叶总黄酮对小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响

取小鼠脱颈椎处死，迅速取肝脏组织以0～4℃的生理盐水洗净血渍，以滤纸吸干水分后称质量，按1:9取相应体积的0～4℃生理盐水于冰浴中将肝组织剪碎、在玻璃匀浆器中制成匀浆液，以3500 r/min离心15min，上清液即为10%肝组织匀浆液。

取0.2mL 10%肝匀浆液和0.1mL 不同含量(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)黄酮样品溶液于试管中混匀，作为测定管，37℃温浴1h(对照以等体积生理盐水代替样品溶液)后，冰浴冷却，加入质量分数8.1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液0.2mL，混匀后再分别加入1.5mL 0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH3.5)和1.5mL质量分数0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，最后加入0.5mL 双蒸水，混匀，避光沸水浴60min，取出后流水冷却至室温，测定波长532nm 处的吸光度(Au)。另外分别取0.3mL 10nmol/mL的四乙氧基丙烷(TEP)对照品溶液和生理盐水作为对照管、空白管，其余操作同测定管，以生理盐水做对照调零，于波长532nm 处测定标准管吸光度(As)和空白管吸光度(A0)。

式中：C为脂质过氧化产物MDA浓度/(nmol/mL)；c为对照品浓度/(nmol/mL)；V0为对照品体积/mL；V为测定样品体积/mL；n为组织样测试前稀释倍数。

由此按式(4)计算样品的抑制率。

式中：c为含抗氧化剂样品中MDA浓度/(nmol/mL)；c0为空白样品中MDA浓度/(nmol/mL)。

另取1 组试管分别测定黄酮样品对H2O2诱导小鼠肝匀浆产生MDA的影响。加入0.1mL 的100mmol/L H2O2，然后各管加0.1mL的10 %肝匀浆液及0.1mL的相应浓度黄酮溶液混匀，于37℃温浴1h(对照以等体积生理盐水代替黄酮样品溶液)，其余步骤同前[6,11]。

1.2.6 统计学分析

实验数据用x±s表示，以SPSS12.0统计软件进行处理，各组之间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞叶总黄酮还原能力

为了确定黑果枸杞叶总黄酮具有抗氧化性，首先对其还原力进行测定。还原力是检验样品是否为一良好的电子供应者(electron donors)，一般情况下，样品的还原能力与其抗氧化活性之间有显著的正相关性，还原力的高低可以反映抗氧化能力的强弱[12]。

图1 黑果枸杞叶总黄酮还原力Fig.1 Reducing power of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr.

从图1可以看出，随着样品质量浓度的增加，吸光度不断升高，吸光度越大，其还原能力越强。在本实验所测定的质量浓度范围内，黑果枸杞叶总黄酮的还原力随其质量浓度的增大而增大。可见黑果枸杞叶总黄酮为良好的电子供应者，他所提供的电子可使Fe3+还原为Fe2+，说明黑果枸杞叶黄酮类物质具有抗氧化潜力。

2.2 黑果枸杞叶总黄酮对小鼠血清羟自由基清除能力的影响

无核红宝石葡萄避雨栽培，伤流期、萌芽期与露地栽培基本一致，其他物候期都发生了相应变化；病虫鸟害发生程度减轻，大大减少了喷药次数和用工数量；减少了雨水对肥料的冲刷，提高了肥料利用率；减轻了裂果。在产量相同条件下，避雨栽培的无核红宝石葡萄优质果率可达到91%，可作为无公害或绿色果品出售，平均售价比露地高3.8元/kg，每亩比露地栽培增收0.8万元。

自由基对生物大分子有损伤作用，对蛋白质的主要作用是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，造成肽链断裂、聚合、交联等损伤。自由基可使DNA 的氢键断裂、碱基降解和主链解旋，所有核酸成分均可受到自由基的攻击。自由基还对不饱和共价键具有一种特殊的亲和力，容易攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，从而引起膜脂质过氧化反应。羟自由基是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它几乎与活细胞中任何生物大分子发生反应，且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基。血清是机体内重要的抑制羟自由基的组织，如加入外源抗氧化剂，可以增强血清的抗氧化能力[6,8]。

图2 黑果枸杞叶总黄酮对小鼠血清羟自由基清除能力的影响Fig.2 Scavenging effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on hydroxyl free radicals in mouse serum

由图2可以看出，黑果枸杞叶总黄酮能增强血清抑制羟自由基的能力，并且随着质量浓度的增加，抑制羟自由基的能力会增强。说明黑果枸杞叶总黄酮具有抗氧化活性，可以预测黑果枸杞总黄酮在生物体内有较强的抗氧化作用。

2.3 黑果枸杞叶总黄酮对红细胞保护作用

红细胞内含有启动和催化脂质过氧化反应的金属络合物血红蛋白，细胞膜上富含多价不饱和脂肪酸，这些特点均使该类细胞对氧化损伤极为敏感，当向红细胞悬液中加入H2O2后，红细胞膜会受到氧化损伤，而导致溶血现象的发生，因此，红细胞膜常被用作分析和筛选天然抗氧化剂的实验体系[6,9]。

图3 黑果枸杞叶总黄酮对红细胞溶血的保护作用Fig.3 Protective effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on H2O2-induced hemolysis of mouse erythrocytes

从图3可以看出，黑果枸杞叶总黄酮对红细胞溶血有抑制作用，保护红细胞结构的完整性，并在一定浓度范围内显示出相应的量效关系，IC50=0.124mg/mL。说明黑果枸杞叶总黄酮有螯合金属离子和有效的减弱体外脂质过氧化反应的作用，它在细胞水平上具有较好的抗氧化活性，这在某种程度上也预示着黑果枸杞叶总黄酮在预防延缓衰老等方面具有一定的应用前景。

2.4 黑果枸杞叶总黄酮对小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响

自由基对生物体的各种氧化损伤中，脂质过氧化被认为是主要的损伤。自由基攻击脂质体中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用。脂质过氧化产物，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。MDA就是其中一种，它是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化的最终分解产物。MDA对生物膜产生严重损伤，直接影响到膜结构和膜流动性，使膜发生交联，脆性增加，MDA的高低间接反应了机体受自由基攻击的严重程度[13]。

肝脏是反映脂质过氧化较为敏感的器官，氧化损伤引起MDA生成量增加。小鼠肝匀浆液中的MDA 含量水平间接反映了脂质过氧化的程度。1个MDA分子与2个硫代巴比妥酸分子在酸性条件下共热， 形成粉红色复合物， 该物在波长532nm有最大吸收峰，可以通过测定粉红色复合物在波长532nm处的吸光度确定MDA的生成量。通过测定MDA的生成量，可知黑果枸杞总黄酮对脂质过氧化具有抑制能力。

图4 黑果枸杞叶总黄酮对脂质过氧化生成MDA的影响Fig.4 Inhibitory effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on MDA generation in mouse liver homogenate by auto-oxidation

图5 黑果枸杞叶总黄酮对过氧化氢引起的脂质过氧化产物MDA生成量的影响Fig.5 Effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on H2O2-induced MDA generation

从图4可以看出，在质量浓度较低时(0～0.16mg/mL)，黑果枸杞叶总黄酮对小鼠肝匀浆自发氧化生成MDA有较好的抑制效果，当质量浓度超过0.16mg/mL后，对MDA的清除率随浓度的升高而下降。而对H2O2引发生成的MDA的清除率(图5)则随质量浓度的升高而升高。说明在一定含量范围内，黑果枸杞叶总黄酮能有效抑制肝组织脂质过氧化产物MDA的生成，表明其在肝脏器官水平上具有明显的抗氧化作用。

3 讨 论

通过生物体外纯化学反应体系实验表明，黑果枸杞叶总黄酮具有体外抗氧化活性，且抗氧化活力与其浓度存在量效关系。在与生物大分子相结合的体外生物模拟反应实验中可以看出，黑果枸杞叶总黄酮在对红细胞溶血的保护作用、对清除小鼠血清羟自由基的影响和抑制小鼠肝脏MDA产生方面都具有显著功效，表现出明显的抗氧化活性。

黑果枸杞叶总黄酮的抗氧化活性主要表现在清除自由基和抗脂质体过氧化方面。黑果枸杞叶总黄酮清除自由基的原理是该化合物具有酚羟基，能与自由基反应，形成共振稳定的半醌式自由基而中断链式反应。共振半醌式自由基的稳定性越大，黄酮类化合物的抗氧活性越强。黑果枸杞叶总黄酮抗脂质体过氧化的机理可能与Gulcin等[13]的报道的相一致。其抗脂质体过氧化机理主要分为两部分，其一是通过供氢与氧化过程中产生的氧自由基(ROS)结合，终止脂质体过氧化的链式反应，达到抑制氧化的作用。其二是与Fe2+的螯合。金属离子Fe2+、Cu2+等是脂质体过氧化的重要促进剂，其主要作用是促进过氧化脂(ROOH)和脂分子(RH)的分解和氧分子活化产生自由基，从而生成多种可以进入脂质氧化链式反应，促进反应发生。黑果枸杞叶总黄酮之所以能抑制脂质体过氧化反应，可能是因为它们提供活泼氢与脂肪酸自由基相结合或与Fe2+螯合，使之转化为惰性化合物，自身形成较稳定的自由基，从而终止自由基连锁反应。如果脂质过氧化被抑制，组成细胞膜脂质当然也免受氧化损伤，从而保护红细胞避免发生溶血现象，同时脂质过氧化产物MDA的生成量就相应减少。

不同黄酮成分其活性有别，实验结果说明黑果枸杞叶总黄酮在生物体外具有抗氧化活性，为其在生物体内实验奠定了实验基础。同时也说明其中具有抗氧化成分，为其作为抗氧化药物、保健品或食品抗氧化剂提供了参考。

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in vitroAntioxidant and Free Radical Scavenging Activities of Total Flavonoids from the Leaves ofLycium ruthenicumMurr.

LI Jin，LI Shu-zhen，FENG Wen-juan，YUAN Hui
(Key Laboratory of Rare and Endangered Species Conservation Biology in Xinjiang, College of Life Science and Chemistry, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China )

In this study, the total flavonoid extract from the leaves ofLycium ruthenicumMurr. was tested for its reducing power, hydroxyl free radical scavenging activity, inhibitory effects on H2O2-induced hemolysis of mouse erythrocytes and on the generation of MDA, one of the end products of lipid peroxidation in hepatic tissue of mice in an effort to assess itsin vitroantioxidant and free radical scavenging activities. The results indicated that the extract could significantly inhibit hemolysis of mouse erythrocytes with an IC50 of 0.124 mg/mL, enhance the tolerance to reactive oxygen species in mouse serum, and reduce MDA generation in hepatic tissue of mice in a dose-dependent manner. Hence, the extract is a promising free radical scavenger and antioxidant.

Lycium ruthenicumMurr；total flavonoids；antioxidant activity；in vitro

R285.5

A

1002-6630(2010)13-0259-04

2009-11-23

新疆维吾尔自治区科技支疆项目(200991240)；新疆师范大学重点实验室重大招标课题(ZXBW08-4)

李进(1969—)，男，副教授，博士，主要从事资源植物化学研究。E-mail：xjcjlj4@yahoo.com.cn