固定化细胞技术及其应用

石小霞，褚可成，陈志梅，薛林贵

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070）

固定化细胞技术及其应用

石小霞，褚可成，陈志梅，薛林贵*

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070）

介绍了细胞固定化的方法、常用细胞固定化载体海藻酸钠和聚乙烯醇的研究，综述了固定化细胞技术在工业、环境中的应用，并对其发展前景进行展望。

固定化细胞，方法，载体，应用

固定化细胞是指细胞受到物理化学等因素被约束或限制在一定的空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力［1］，1959年，Hattori和Furusaka首次应用树脂吸附法吸附E.coli，实现了细胞固定化；20世纪70年代固定化细胞技术在固定化酶基础上逐步发展形成，与酶固定化相比较，其具有以下优点：a.无需进行酶的分离提取；b.酶的稳定性高；c.可进行细胞酶体系的多步酶反应等。因此，固定化细胞技术比固定化酶技术发展更迅速，应用更广泛。细胞固定化具有细胞密度大、可增殖、缩短发酵周期、发酵稳定性好、可实现反复使用、有利于产品的分离提取等特点，在连续反应中占有明显的优势，主要被应用于工业、农业、医学、化学分析、环境保护、能源开发等领域。但细胞固定化也有其缺点：易产生副产物；细胞质膜与其他质膜的存在使传质难度增加；细胞自溶导致产物浓度下降等制约了它的应用。合适的固定化载体的选择是细胞固定化的关键［2］，目前对固定化细胞的研究颇多，国内外学者对载体性能也进行大量的深入研究。本文就细胞固定化方法与载体的选择、细胞固定化及其应用和发展前景进行综述。

1 细胞固定化方法

细胞固定化方法的分类就有很多种［3］，目前国内外还没有统一的分类标准。如成庆利［4］等人根据有无外加载体，将细胞固定化分为有载体固定化和无载体固定化，崔建涛等［5］对有载体固定化细胞和无载体固定化细胞的研究应用进一步作了详细叙述。在细胞固定化方法上基本上与固定化酶技术相似，常用的细胞固定方法有吸附法、包埋法、交联法、共价结合法、絮凝法以及多种固定化法联用等，其中以吸附法和包埋法最为常见。

1.1 包埋法

包埋法是指将细胞定位于凝胶网格内或聚合物半透膜微胶囊中，形成的结构可以防止细胞渗漏，但允许底物进入、产物扩散出。具有细胞容量大、条件温和、操作简便、酶活力高、回收率高、固定化细胞球的强度高等优点，是固定化细胞中应用最多的方法。其缺点是扩散阻力大、不适合催化大分子底物与产物的转化。常用的载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶及海藻胶等。

1.2 共价结合法

依靠细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该方法具有细胞与载体结合紧密、不易脱落等优点，但是反应剧烈、条件难控制、细胞活性损失大、制备较难。

1.3 交联法

该方法主要是通过多功能试剂与细胞表面的基团（巯基、羟基、氨基等）发生化学反应形成共价键，实现细胞的固定化。该方法的突出特点是细胞与载体结合紧密，但化学反应剧烈，使细胞活性大大降低，制备麻烦，故交联法的实际应用很少。戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双偶氮联苯等是最常用的交联剂。

1.4 吸附法

吸附法是细胞与载体间通过物理吸附或离子作用结合将细胞固定在载体上的方法。该方法操作简单，对细胞的影响小，但是吸附力小、细胞易脱落。常用的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、中空纤维、金属丝网等，其广泛应用于废水处理中。

表1 各种细胞固定化方法的特征比较

2 固定化细胞载体的研究现状

目前，固定化技术所使用的载体材料主要分为三大类：有机高分子材料、无机载体和复合载体［6］。有机高分子材料分为天然高分子载体如海藻酸钠、明胶、卡拉胶等，一般对生物无毒性、传质性能好、但强度低、寿命短、在厌氧环境下易被降解；另外一种是合成高分子载体，常见的有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等，合成高分子载体强度大，但传质性能差。无机载体有活性炭、硅藻土、砂粒、多孔陶珠、高岭土、沸石等，主要是利用吸附和电荷效应将细胞固定住，具有机械强度大、无毒害、不易被降解、制备容易等特点。高分子载体和无机载体各有优缺点，将其二者结合互补可形成复合载体。

理想的载体材料的选择应具备：a.机械强度高、稳定性能好、常温易成型；b.对微生物低毒害、不易被微生物降解；c.具有多孔性、传质快；d.没有特异性吸附、有适合引入配基的官能团；e.寿命长、价格低廉等特点［7］。目前研究和应用比较广的细胞固定化载体主要有海藻酸钠和聚乙烯醇。

2.1 海藻酸钠

海藻酸钠是由d－甘露糖醛酸和L－古罗糖醛酸通过1，4键连接组成，具有无毒、来源丰富、价格低廉，并且操作简便、条件温和、适用于固定活细胞和敏感细胞等优点，是一种广泛应用的固定化介质。利用海藻酸钠与钙离子交联形成不溶于水的凝胶，将细胞固定在凝胶小球中。

李娜等［8］对不同浓度的海藻酸钠与不同浓度的氯化钙反应包埋啤酒酵母细胞的条件进行了研究，发现用2%海藻酸钠与4%氯化钙制得的固定化细胞发酵性能和机械强度均最佳。

海藻酸钠浓度对固定化细胞发酵具有重要影响，一般浓度越大凝胶性能越好，但是最适浓度的确定要根据具体实验来选择［9］。吕红线［10］研究发现，海藻酸钠浓度分别为1%、2%、3%、4%固定化细胞，L－乳酸发酵水平均低于游离细胞发酵水平，并且随着海藻酸钠浓度的增加而减少；1%浓度的海藻酸钠制得的固定化细胞强度小、易破壁、稳定性差；4%浓度稳定性好，硬度过强，形成的胶珠直径大，不利于生长；适当的海藻酸钠浓度可以确保发酵高产量、使固定化细胞稳定性与活性都比较高。综合考虑使用2%浓度的海藻酸钠，选择凝胶直径2.5～3.0mm适用于发酵产酸。

宋慧一等［11］采用2种不同的方法针对海藻酸钙凝胶在多价阴离子或高浓度电解质容易不稳定，钙离子易脱落，凝胶变软等进行改性。方法分别为：a.添加法：在海藻酸钠溶液中添加一定比例的Al2O3、MgO、CaCO3和SiO2，结果表明，MgO添加到固定化细胞中的效果最好，可以明显增加固定化细胞的强度。进一步研究发现MgO质量分数为1%时，固定化强度最大。b.置换法：将固定化细胞在一定的置换溶液中置换 18h，置换物选用 ZnSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4、Al（NO3）3和AlCl3，发现Al（NO3）3效果最好，Al3+将海藻酸钙置换出来，减少了磷酸盐对固定化细胞的破坏。采用添加1%的Al（NO3）3可以获得最长的寿命，酒精产率增加0.9%。

宋威［12］等采用明胶、琼脂以及聚乙烯醇分别与海藻酸钠混合制备成3种载体固定桔青霉细胞，通过对载体各项性能的研究结果发现，复合载体的包埋效果、传质性能以及强度都明显强于海藻酸钠单载体包埋，产酶效果也明显提高。海藻酸钠与聚乙烯醇比例为1∶2时，载体机械强度、化学稳定性、使用寿命长、重复性较好以及产酶能力好，具有很强的工业应用价值。

2.2 聚乙烯醇（PVA）

聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，简称PVA）是一种人工合成的有机多聚体凝胶，作为包埋载体有机械强度高，化学性能稳定、对微生物无毒、抗微生物分解能力强、价格低廉和使用寿命长等优点［13］。近年来国内外进行了大量的研究。

目前，研究的聚乙烯醇细胞固定方法有三种：聚乙烯醇－硼酸交联法，聚乙烯醇冷冻法以及聚乙烯醇与其他载体形成的复合载体固定法。利用聚乙烯醇和卡拉胶固定耶罗维亚酵母生产λ－癸内酯，聚乙烯醇80g/L、卡拉胶5g/L时，固定化细胞发酵能力提高了40%［14］。陈功等［13］分别研究了利用PAV冷冻法和PVA－H3BO3交联固定法发酵酒精的性能，方法为：a.PVA冷冻法：8%PVA水浴至40℃与35℃菌液按10∶1比例混合，在－10℃条件下冷冻12h后室温解冻30min，在相同条件下冷冻，最后取出室温解冻，用生理盐水冲洗，制成凝胶。b.PVA－H3BO3法：将加热溶于水冷却的10%聚乙烯醇与菌液按10∶1比例混合，用与无菌注射器滴入饱和硼酸液中交联24h，交联好颗粒用无菌水冲洗，浸泡数小时。将制成的载体放入发酵液发酵，结果表明，PVA－H3BO3适用于单批量发酵，PVA冷冻法多次连续发酵性能良好，并且乙醇产量良好，适用于连续发酵。

在固定化细胞技术中常采用聚乙烯醇作为包埋介质，但是聚乙烯醇固定化颗粒吸水性强，时间长了易碎。为了改进它的耐用性，就要改进水溶膨胀性［15］，海藻酸钠与其共固定化可以有效弥补，利用海藻酸钠与PVA共固定化细菌进行脱硫，发现小球强度增加，降解率提高，重复脱硫的能力也比游离细胞有很大提高［16］。李华子［15］等分别采用延时包埋法和加入化学药剂法对聚乙烯醇－硼酸进行了改进，结果表明，延时包埋法处理和加入单体丙烯酸胺与交联剂N，N′－亚甲基双丙烯酰胺化学药剂法使水溶性得到了改善，固定化细胞使用寿命增长。

2.3 其他载体

壳聚糖可以通过包埋、吸附等达到固定细胞的目的，是优良的固定化细胞载体。以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基制备固定化酵母细胞壳聚糖球，得到的苯乙酮酸转化率和D－扁桃酸的e.e值高于游离酵母细胞，且有操作和贮存稳定性［17］；泡沫陶瓷作为细胞固定化载体研究很少，但是其性能完全达到固定化载体的要求，它作为细胞固定化材料是可行的；张兰等［18］采用廉价的陶土为材料，采用有机泡沫浸渍工艺对此进行了性能开发研究。聚氨酯泡沫在固定化培养盘基网柄菌［19］和固定化产脂肪酶粗状假丝酵母细胞［2］的研究表明，这是一种性能优良的载体，适合工业化使用。其他载体如膜载体、新型光交联聚氨酯［20］等也得到广泛的研究与应用。

3 固定化细胞的应用

固定化细胞的优越性使其广泛应用于医药、食品、轻工业、化工、环保、能源等领域，显示出巨大的发展潜力。以下主要介绍固定化细胞在工业和环保中的应用。

3.1 工业上的应用

固定化细胞研究与应用目前还处于研究阶段，高性能固定载体的选择与研发、固定化细胞性能与生产条件的研究、生物反应器的研发还有待发展，因此，大规模生产应用受到限制。但是，世界各国把固定化细胞研究的成果应用于生产已产生了很大的经济价值。目前在生产酒精、啤酒、氨基酸、果葡萄糖浆、L－苹果酸、抗生素等取得了初步的成果。固定化细胞用于发酵酒精的研究始于1976年，目前在工业生产中最成熟、最深入，常用海藻酸钠、活性炭、纤维素、中空纤维等载体进行固定化发酵。陆兆新［21］等研究发现采用辐射聚合手段用HEA－GMA单体聚合固定酵母细胞，酒精产量是游离细胞的3倍；熊亚［22］等采用海藻酸钠固定法对固定化酵母菌与游离酵母菌产酒精的酒度、酸度、发酵液糖度进行测定，结果表明，固定化酵母发酵产酒精的性能均好于游离酵母发酵。葡萄酒及果酒采用固定化发酵［23］质量和风味明显改善提高。

3.2 环境保护方面的应用

近年来环境问题日益严峻，迫切需要一种高效、快速、二次污染小的废水、废气处理方法。分离、筛选出优势菌种加以固定，增强了细胞对有毒或高渗物质的承受能力和降解能力，细胞固定技术得到了广泛应用，可用于处理氨氮废水、难降解的有机废水、含BOD物质废水、重金属废水、有色废水、废气［24］等。难降解的有机废水经人工固定化生物活性炭滤池对油类的去除率达到90%，COD去除率也高达80%，比未固定的活性炭滤池的处理效果好［25］。李海英等［26］用PVA包埋对氯代芳香类有机化合物具有高效降解的菌群，停留时间为2.3h时，对造纸漂白废水去除率可稳定在65%～82%。氧化亚铁硫杆菌脱硫是一种有效的生物脱硫法，用聚胺树脂泡沫、砂粒、硅石、焦炭等吸附法或海藻酸钠、角叉菜胶等包埋法都能显著提高氧化亚铁硫杆菌的氧化活性［27］。

4 展望

固定化细胞技术因其优点受到广泛的关注，在应用中显示了明显的优势，但是目前不够成熟，还处于研究探索阶段。固定化方法的改进、寻求更新更适合于固定化的载体材料、优良菌种选育、高效固定化生物反应器的研制、多细胞固定化生产的研究等是实现固定化细胞技术大规模应用的重要途径，随着生物、材料等技术的不断发展进步，固定化细胞技术研究将会有更进一步的发展，获得更广泛的应用。

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Cells immobilization technique and its application

SHI Xiao－xia，CHU Ke－cheng，CHEN Zhi－mei，XUE Lin－gui*
（School of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

In this paper，the methods of immobilized cells and research on the common immobilized carriers of sodium alginate and PVA were introduced，meanwhile overview of application of immobilized cell technology in the industry and the environment，including prospect of its development prospects.

cell immobilization；methods；carrier；application

TS201.1

A

1002－0306（2010）12－0380－04

2009－11－11 *通讯联系人

石小霞（1985－），女，研究生，研究方向：微生物生理生化。

甘肃省科技支撑计划项目（090NKCA079）；国家自然科学基金项目（30870384）。