响应面法优化月见草籽油中γ-亚麻酸的富集工艺参数

欧阳辉，张永康，陈功锡，田启建

（吉首大学/植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首416000）

响应面法优化月见草籽油中γ-亚麻酸的富集工艺参数

欧阳辉，张永康，陈功锡，田启建

（吉首大学/植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首416000）

利用响应面法对月见草籽油中γ－亚麻酸的富集工艺参数进行优化。在单因素实验基础上选取实验因素与水平，根据中心组合（Box－Benhnken）实验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的影响因素，以富集产物的γ－亚麻酸含量和γ－亚麻酸的回收率为响应值作响应面分析，得出最佳工艺条件为：包合温度为－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）为3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）为8∶1，包合时间为15.6h，此工艺条件下产品中γ－亚麻酸含量可达53.60%，γ－亚麻酸回收率达94.48%。

月见草，γ－亚麻酸，尿素包合法，富集，响应面

1.1 材料与仪器

超临界萃取月见草籽油 吉首大学超临界流体萃取实验室提供；无水硫酸钠、石油醚、无水乙醇、尿素等 均为分析纯。

GC－2010型气相色谱仪、GCMS－QP2010质谱仪（NIST05.LIB标准库） 日本岛津公司；FA2004电子天平 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；HH－2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；RE52－99旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酸组成及含量测定

1.2.1.1 实验条件 GC条件：GC－2010型气相色谱仪，色谱柱2m×4mm，填充80～100目ChromosorbW，涂以8%（W/W）二乙二醇琥珀酸酯（DEGS）（3mm× 2.5m），柱温 210℃，进样器温度 260℃，氮气流速40mL/min。MS条件：GCMS－QP2010，EI离子源，源温200℃，电子能量70eV，连接器温度280℃，运行时间35.5min，质量扫描范围（m/z）：29～600。

1.2.1.2 操作步骤 称取30～100mg（约2～6滴）油脂，置入10mL量瓶内，加入1～2mL正己烷和苯的混合溶剂（1∶1），摇动使油脂溶解。加入1～2mL氢氧化钾（0.4mol·L－1）－甲醇溶液，混匀。在室温静置5～10min后，加蒸馏水使全部苯甲酯溶液升至瓶颈上部，放置待澄清（如上清液浑浊而又急待分析时，可滴入数滴无水乙醇，1～2min内即澄清）。吸取上清液，在室温下吹入氮气使其浓缩，所得浓缩液即可用于气相色谱分析。

1.2.2 混合脂肪酸的制备 超临界萃取月见草油按一定比例加入3%的NaOH－乙醇溶液，置于锥形瓶中，在60℃的水浴中加热回流（N2保护），磁力搅拌1h，得皂化液。冷却至室温后，加入适量水使生成的少量皂完全溶解，用10%的HCl溶液酸化混合液至pH2～3，加正己烷萃取，分层，去下层的水层。有机相水洗至中性，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，用旋转蒸发器蒸出溶剂，得到混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合法富集γ－亚麻酸响应面法实验设计

称取混合脂肪酸40g，按照相应比例依次加入乙醇、尿素，其中尿素分 3次加入，加入量递减。60～70℃加热搅拌1h至溶液透明澄清。室温冷却30min后，于不同温度下进行包合反应，析出尿素包合结晶物，一定包合时间后取出，迅速减压抽滤除去结晶，滤液经回收乙醇、稀酸及饱和盐水洗后得到富集γ－亚麻酸产物，称重后取样测定γ－亚麻酸含量。

γ－亚麻酸回收率（%）=（富集产物质量×富集产物中γ－亚麻酸含量/混合脂肪酸质量）×100%

根据前期预备单因素实验，采用 Design Expert7.16统计软件，利用响应面方法（RSM）中的Box－Behnken设计进行实验设计，以包合温度（℃）、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）和包合时间（h）四个因素为自变量，以富集产物的γ－亚麻酸含量和γ－亚麻酸的回收率为响应值，每个因素取三水平，以－1、0、+1编码，并根据单因素实验结果选定三因素的零水平和波动区，采用Box－Beheken实验设计实际考察的变量及其实验水平编码见表1。

2 结果与讨论

2.1 超临界萃取月见草油各脂肪酸的组分和含量

超临界CO2萃取月见草籽油脂肪酸经甲酯化处理后，通过色谱数据分析，月见草籽油脂肪酸的组成见表2。

表1 中心组合设计因素水平表

表2 超临界萃取月见草油中组分含量结果表（%）

2.2 月见草籽油提取率中心组合设计实验结果及响应面优化分析

按照Box－Beheken实验设计原理的实验方案进行四因素三水平实验，实验结果见表3。

表3 Box－Behnken实验设计及结果

表3中，实验号1～24是析因实验，实验号25～29是中心实验。29个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。采用Design－Expert软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表4、表5。

2.3 回归模型的建立及分析

采用Design－Expert软件对表4、表5的实验数据进行多元回归拟合，得到富集产物中γ－亚麻酸含量和γ－亚麻酸的回收率对包合温度、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/尿素（v/w）和包合时间四个因素的二次多元回归方程如下：

产物中γ－亚麻酸含量：

表4 响应面模型方差分析表（γ－亚麻酸含量）

表5 响应面模型方差分析表（γ－亚麻酸回收率）

γ－亚麻酸的回收率：

2.4 工艺条件的确定

根据回归模型通过Design Expert软件分析得出，富集产物的γ－亚麻酸含量和γ－亚麻酸的回收率最高时的最佳工艺条件是：包合温度为－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）为3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）为8∶1，包合时间为15.6h，根据上述条件进行3次重复实验，得出实际富集产物的γ－亚麻酸含量为53.60%，γ－亚麻酸的回收率为94.48%，与预测值基本一致，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对尿素包合法富集月见草籽油中γ－亚麻酸的工艺进行回归分析和参数优化。

3 结论

3.1 通过响应面分析优化的尿素包合法富集超临界萃取月见草籽油中γ－亚麻酸的最佳条件：包合温度为－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）为3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）为8∶1，包合时间为15.6h，产品中γ－亚麻酸含量可达 53.60%，γ－亚麻酸回收率达94.48%。

3.2 尿素包合法富集超临界萃取月见草籽油中γ－亚麻酸，条件温和、工艺简单、成本低廉，是制备高纯度γ－亚麻酸的有效办法，为实现工业化生产提供了经济可行的工艺技术参考，具有广阔的前景。

［1］李国栋，范伟，陆国浩，等.月见草油的研究概况［J］.药学实践杂志，2003，21（3）：171－173.

［2］周立新，黄凤洪，李文林，等.α－亚麻酸与γ－亚麻酸［J］.西部粮油科技，2000，25（6）：46－18.

［3］翁新楚，董新伟，任国谱.脲包法在脂类分离技术中的应用［J］.中国油脂，1994，19（6）：40－44.

［4］杨文雄，高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用［J］.中国食品添加剂，2005（2）：68－71.

［5］LI Q H，FU C L.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein［J］.Food Chemistry，2005，92（4）：701－706.

Study on optimization of γ－linolenic acid enrichment from evening primrose seeds oil by response surface methodology

OUYANG Hui，ZHANG Yong－kang，CHEN Gong－xi，TIAN Qi－jian
（Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province/Jishou University，Jishou 416000，China）

Based on single factor tests，the optimum enriching condition of γ－linolenic acid from evening primrose seeds oil with urea adduct method was obtained through Box－Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum enriching condition of polysaccharides were as follows：inclusion temperature－10℃，ratio of urea adduct to fatty acid（w/w）was 3∶1，ratio of 95%ethanol to fatty acid（v/w）was 8∶1，inclusion time 15.6h.Under such condition，the purity of γ－linolenic acid was 53.60%，the rate of γ－linolenic acid recovery was 94.48%.

evening primrose；γ－linolenic acid；urea adduct method；enrichment；response surface methodology

TS225.1+4

B

1002－0306（2010）12－0243－04

月见草（Oenothera biennis L.）系柳叶菜科1年或2年生草本植物，俗名山芝麻，由于夜间开花，花朵黄色，淡香幽雅，又名夜来香。据文献资料记录，月见草种子含油20%～30%，其中γ－亚麻酸约7%～14%左右［1］。γ－亚麻酸是人体必需的不饱和脂肪酸，是人体内具有重要的生理活性的组成物质［2］。尿素包合法是不饱和脂肪酸的常用富集方法，其基本特点是可将混合物脂肪酸按饱和度的差异进行分离。其优势在于：设备简单，工艺简便，不在高温下进行反应，脲包物形成后，还可有效地保护双键不受氧化，不会对不饱和脂肪酸的分子结构和理化性质产生影响，能较完全地保留其营养与生理活性［3］。响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面［4］。它与正交实验设计法不同，具有实验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点［5］。本研究以富集产物的γ－亚麻酸含量和γ－亚麻酸的回收率为评价指标，以包合温度、尿素/混合脂肪酸比例、95%乙醇/混合脂肪酸比例和包合时间四个因素为自变量，利用响应面分析法优化尿素包合法富集月见草籽油中γ－亚麻酸的工艺条件，得到最佳富集参数，为更好地利用我国月见草资源，为实现工业化生产提供实验基础和技术依据。

1 材料与方法

2009－11－13

欧阳辉（1979－），男，理学学士，实验师，主要从事天然生物活性成分研究。

湖南省教育厅重点资金资助项目（02A037）。