黑曲霉生产葡萄糖酸钠的分批发酵动力学模型

张小昊，童群义

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

黑曲霉生产葡萄糖酸钠的分批发酵动力学模型

张小昊1，童群义2，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

对黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的分批发酵动力学特性进行了研究，通过对Logistic方程，Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret/Like方程进行最优参数估计和非线性拟合，得到了描述发酵过程中菌体生长、葡萄糖酸钠合成、葡萄糖消耗的动力学模型。对实验数据与模型预测值进行比较，发现模型预测值与实验数据能较好地拟合，基本上反映了黑曲霉分批发酵过程的动力学特征，结果还表明葡萄糖酸钠的发酵合成是部分生长偶联型的。

黑曲霉，葡萄糖酸钠，动力学模型

葡萄糖酸钠是一种多羟基羧酸钠，又名五羟基己酸钠，是一种白色或淡黄色结晶粉末，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。其分子式为C6H11O7Na，相对分子质量为218.14［1］。葡萄糖酸钠是葡萄糖的深加工产品，也是制备葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸盐（锌、铜、亚铁盐）等的基础原料，在食品工业中可用作营养增补剂、固化剂、缓冲剂等［2-3］。该产品热稳定性好，无潮解性，由于其优良的螯合性能而被广泛用于水质处理、电镀、金属与非金属的表面清洗及水泥生产等多种工业部门，在化工、食品、医药等行业也有广泛的用途。目前对于发酵法生产葡萄糖酸钠的研究主要集中在菌种选育、培养基及培养条件优化等方面［4-6］，对发酵动力学方面的报道较少［7］，且实验条件与工业发酵条件差异较大。本研究在5L发酵罐中进行葡萄糖酸钠的高糖分批发酵实验，研究了发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗的动态平衡及其内在规律，获得了相应的动力学数学模型和模型参数，为实验数据的放大和由分批发酵过程到连续发酵过程提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉（Aspergillus niger）M2632 由本实验室诱变筛选得到，该菌株有较高的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活力；斜面培养基 PDA培养基；种子培养基（g/L） 葡萄糖80、MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.3、（NH4）2HPO40.6，自然pH（约6.5）；发酵培养基（g/L）葡萄糖250、其它同种子培养基，自然pH（约6.0）；葡萄糖、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；UV2000型分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计 杭州雷磁分析仪器厂；HH-S24型恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂；AB104-N型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台 苏净集团安泰空气技术有限公司；303-4型恒温培养箱南通科学仪器厂；HYG-Ⅱa型回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司；KF-5L型发酵罐 高百特发酵机有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 斜面种子培养 将4℃贮藏的斜面菌种接种到新鲜的PDA斜面上，28℃下恒温培养3d。

1.2.1.2 摇瓶种子培养 从斜面培养基上挑取几环黑曲霉孢子，接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃，250r/min下摇床培养22h，即为种子液。

1.2.1.3 发酵罐培养 按10%的接种量将种子液接入灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐装液量为2L。发酵条件为：温度 32℃，搅拌速率 550r/min，通气量3.5NL/min，必要时用灭菌的花生油进行消泡，发酵过程中用10.3mol/L NaOH溶液自动控制发酵液pH在6.0。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量的测定 定量量取发酵液，用已烘至恒重的滤纸过滤，并用蒸馏水冲洗滤出物2次，所得滤液用于残糖的测定，将滤纸连同滤出物于85℃烘干至恒重，前后滤纸质量的差值即为发酵液中的菌体生物量［8］。

1.2.2.2 残糖的测定 取生物量测定过程中所得滤液，定容，取一定量滤液，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定［9］。

1.2.2.3 葡萄糖酸钠的测定 用保持发酵液pH为6.0、所消耗10.3mol/L NaOH溶液的量计算得到，与葡萄糖酸钠产量相比，此处忽略形成其它副产物消耗NaOH的量［10］。

1.2.3 实验数据的获得 每隔一定时间，测定此时的生物量、残糖含量和葡萄糖酸钠浓度。每次做两个平行实验，取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉发酵过程中的生长代谢变化

此前的研究已对黑曲霉发酵葡萄糖酸钠的培养基和培养条件进行了优化，为了弄清楚黑曲霉在该培养基和培养条件下的生长代谢规律，进行了分批发酵实验，结果见图1。

图1 黑曲霉分批发酵曲线

从图1可以看出，黑曲霉的细胞生长曲线存在延滞期、对数期、稳定期等几个期段，0～4h发酵处于延滞期，菌体浓度增长缓慢，大的菌丝球由于剪切力的作用逐渐变小；4～32h处于对数期，菌体生长加速，菌体浓度迅速增加，菌体呈松散且分散均匀的菌丝小球状；32h后进入稳定期，菌丝球体积稍有变大，菌体浓度趋于稳定，菌体最大浓度为2.143g/L。从底物消耗和产物形成曲线可以看出，0～8h时，由于菌体处于延滞期，且菌体量较少，葡萄糖消耗及葡萄糖酸钠合成均比较缓慢，8～40h，伴随菌体量的快速增加，葡萄糖消耗及葡萄糖酸钠合成速度加快，40h后，由于底物消耗殆尽，葡萄糖酸钠合成减缓。从图中还可以看出，葡萄糖酸钠的合成在生长阶段和稳定期都有大量形成，且明显滞后于菌体的生长，因此预测本实验条件下黑曲霉产葡萄糖酸钠的发酵过程属于部分生长偶联型，即Gaden提出的Ⅱ型发酵。

2.2 动力学模型的建立

2.2.1 黑曲霉菌体生长动力学模型 关于菌体生长的动力学模型，目前多采用非结构模型来描述。Monod方程是描述菌体生长较常用的模型之一，然而由于Monod方程只适用于单一限制性基质及不存在抑制性物质的情况，并且该模型是在假设微生物生长的菌体得率为常数的情况下建立的，因此，该模型不适于本实验，通过初步模拟，采用Monod方程模拟确实有较大偏差。而Verhulst-Pearl提出的Logistic方程也是目前应用较为普遍的模型之一，由于黑曲霉菌体生长曲线为S形，Logistic模型也是一个典型的S型曲线，通常被看作是一个表现细胞生长与营养物质之间的非线性关系的经验方程，能很好地反映该过程中菌体浓度增加对自身生长的抑制作用，因此，选用Logistic方程作为黑曲霉菌体生长动力学模型。Logistic方程为：

式中：μm为最大比生长速率（h-1）；t为发酵时间（h）；X为菌体浓度（g/L）；Xm为最大菌体浓度（g/L）。

当初始条件为t=0，X=X0时，对式（1）进行积分，可得：

式中：X0为初始菌体浓度（g/L）。

2.2.2 葡萄糖酸钠合成动力学模型 根据产物形成与菌体生长的关系，Gaden将产物形成分成3类：a.产物形成与细胞生长相偶联；b.产物形成与细胞生长部分偶联；c.产物形成与细胞生长没有关系。Luedeking和Piret为此总结出Luedeking-Piret方程来描述产物形成与细胞生长的关系［11］，即：

式中：P为葡萄糖酸钠浓度（g/L）；α、β为动力学参数；α（dX/dt）为与菌体生长率相关的产物形成率；βX为非伴随菌体生长的产物形成率。

当α=0，β≠0时，产物形成与细胞生长为非偶联型；当α≠0，β≠0时，产物形成与细胞生长为部分生长偶联型；当α≠0，β=0时，产物形成与细胞生长为生长偶联型。本文中葡萄糖酸钠的合成属于部分生长偶联型，当初始条件t=0，X=X0，P=P0时，将方程式（1）代入式（3）进行积分，可得：

表1 分批发酵动力学模型参数估计值

式中：P0为最初葡萄糖酸钠量（g/L）。

2.2.3 底物消耗动力学模型 发酵过程中，底物（葡萄糖）消耗主要有三个方面：一是菌体生长的消耗，即用以合成新的细胞；二是用于合成代谢产物的消耗；三是菌体维持基本生命活动的消耗。因此底物消耗可用Luedeking-Piret/Like方程表示［12］，即：

式中：S为葡萄糖浓度（g/L）；Yx/s为葡萄糖用于菌体生长的得率常数；Yp/s为葡萄糖用于产物积累的得率常数；m为维持常数。

当初始条件t=0，X=X0，S=S0时，将方程式（1）、式（3）代入式（5）进行积分，可得：

试卷应用过程，如发现有错误需要更改或更新，可以在原来的基础上重新编辑考试。在编辑考试过程中，无法作答，直到编辑结束，重新发布，但修改后的试卷二维码保持不变。编辑考试过程有保留答卷、删除已有答卷、复制此问卷并编辑三种方式。如保留已有答卷，则编辑过程不能删除题目，新增题目只能插入到问卷的最后；如删除已有答卷，则修改不受限制，可以随意删除题目和任意位置插入新题目；如选择复制此问卷并编辑，则原试卷及答卷均不受任何影响，新编辑的试卷二维码和原试卷不同。

式中：S0为最初残糖量（g/L）。

2.3 模型参数的求解

根据实际测得的数据，应用国产1stOpt软件，采用麦夸特法和通用全局优化算法，分别对图1中分批发酵的菌体生长曲线、产物生成曲线和底物消耗曲线进行非线性曲线拟合，得到拟合曲线，并得到参数最优估计值（表1）。

根据表1数据，得到葡萄糖酸钠发酵的动力学模型分别为：

菌体生长动力学模型：

底物消耗动力学模型：

图2a、图2b、图2c分别为葡萄糖酸钠分批发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗实验值与模型计算值的比较（图中点表示实验值，线表示模型计算值），其相关系数R2分别达到0.9976、0.9948和0.9966，可见这三个模型能很好地描述分批发酵过程中菌体生长、葡萄糖酸钠合成以及葡萄糖消耗情况。

图2 葡萄糖酸钠分批发酵菌体生长、产物生成及底物消耗的实验值与模型拟合曲线

2.4 曲线拟合与模型准确性分析

为了检验模型的准确性，在相同发酵条件下进行分批发酵的重复实验，对分批发酵的实验值与模型计算值进行比较，结果见表2。

从表2可以看出，除个别数据点外，大部分模型计算值与实验值之间的相对误差均低于10%，说明所得模型能很好地描述葡萄糖酸钠的分批发酵过程。发酵初始的葡萄糖酸钠浓度的实验值与模型计算值的相对误差过大，这是由于实验值为零所致；发酵终点葡萄糖浓度的实验值与模型计算值的相对误差也很大，可能是由于模型的建立未考虑发酵终点值不能为负，而且此时残糖量接近于零，测量误差相对较大，计算模型平均误差时可不考虑这两点。菌体浓度、产物生成和底物消耗模型计算值与实测值的平均相对误差分别为3.36%、4.95%和3.21%，较好地反映了实际的发酵过程。

3 结论

3.1 通过对本实验条件下的菌体生长曲线和产物合成曲线分析可得出，葡萄糖酸钠量的增长趋势明显滞后于细菌生长的增长趋势，其发酵过程属于部分生长偶联模型，即Gaden提出的Ⅱ型发酵。

3.2 采用 Logistic方程、Luedeking-Piret方程与Luedeking-Pire/Like方程，建立的葡萄糖酸钠发酵模型能够较好地描述黑曲霉分批发酵过程中菌体生长、产物形成和底物消耗随时间的变化过程。

3.3 该模型是在初始葡萄糖浓度较高的条件下建立的，且有很好的适用性，因此，可以用来预测高糖发酵时发酵液中产物的浓度，判断发酵过程是否正常，从而对发酵条件加以改变，实现发酵过程的最优化控制。

［1］黄道震，余丽秀，王桂香，等.葡萄糖酸钠的生产工艺及研究动态［J］.河南化工，1999（5）：35-36.

［2］郑锦华，吴绍林.葡萄糖衍生产品的生产与市场［J］.河南化工，1997（6）：14-15.

［3］Singh O V，Kumar R.Biotechnological production of gluconic acid：future implications［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，（75）：713-722.

［4］Amit S，Vivekanand V，Singh R P.Solid-state fermentation forgluconic acid production from sugarcane molasses by Aspergillus niger ARNU-4 employing tea waste as the novel solid support［J］.Bioresource Technology，2008，99：3444-3450.

［5］Mukhopadhyay R，Chatterjee S，Chatterjee B P，et al. Production of gluconic acid from whey by free and immobilized Aspergillus niger［J］.International Dairy Journal，2005，15：299-303.

［6］Ikeda Y，Enock Y P，Okuda N.Bioconversion of waste office paper to gluconic acid in a turbine blade reactor by the filamentous fungus Aspergillus niger［J］.Bioresource Technology，2006，97：1030-1035.

［7］ZNAD H，BLAŽEJ M，BÁLEŠ V，et al.A Kinetic Model for Gluconic Acid Production By Aspergillus niger［J］.Chemical Papers，2004，58（1）：23-28.

［8］路秀玲，赵树欣.红曲霉固态发酵中生物量的测定方法［J］.食品与发酵工业，2000，27（6）：45-48.

［9］陈毓荃.生物化学实验方法和技术［M］.北京：科学出版社，2005：95-100.

［10］Sankpal N V，Kulkarni B D.Optimization of fermentation conditions for gluconic acid production using Aspergillus niger immobilized on cellulose microfibrils［J］.Process Biochemistry，2002，37：1343-1350.

［11］陈坚，堵国成，李寅，等.发酵工程实验技术［M］.北京：化学工业出版社，2003：281-284.

［12］于雷，裴晓林，雷霆.L-乳酸生产菌分批发酵动力学模型［J］.食品工业科技，2008，29（5）：100-102.

Kinetic models for sodium gluconate batch fermentation by Aspergillus niger

ZHANG Xiao-hao1，TONG Qun-yi2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The kinetic models for sodium gluconate batch fermentation by Aspergillus niger were studied.Through the optimal parameters estimation and nonlinear fitting method，series of kinetic models were proposed by using the Logistic equation for cell growth，the Luedeking-Piret equation for sodium gluconate production and the Luedeking-piret/Like equation for glucose consumption.The calculated results of models were compared with experimental data，the results showed the experiment and model values were in a good agreement，the model appeared to provide a reasonable description for the batch fermentation process，and the results also showed the production of sodium gluconate was partially growth-associated.

Aspergillus niger；sodium gluconate；kinetic model

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0221-04

2009-12-16 *通讯联系人

张小昊（1986-），男，硕士研究生，主要从事碳水化合物的研究。