用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒

范学政,宁宜宝,王 琴,徐 璐,沈青春

(中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室,北京海淀100081)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)均属黄病毒科(F laviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)成员。近几年牛感染BVDV而持续带毒现象时有发生。猪瘟细胞苗在生产过程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等材料,这些材料中若带有低滴度的BVDV病原,会造成猪瘟细胞苗的污染。另外,用含BVDV抗体的牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养[1]。更为严重的是,猪使用污染的猪瘟疫苗后可感染BVDV,出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化[2]。王新平等也从我国疑似猪瘟病料中检出了 BVDV[3]。但BVDV株与CSFV株的核苷酸同源性约60%,氨基酸同源性约85%[4],在血清学上存在交叉反应[5],因而血清学方法难以区分,用常规的病原检测方法难以对BVDV和CSFV进行鉴别检测和诊断。目前,我国猪瘟活疫苗中BVDV污染情况时有发生,对疫苗质量带来很大危害,为了调查BVDV在我国猪瘟活疫苗中的污染情况,建立特异敏感的 RTPCR方法对猪瘟细胞活疫苗进行检测,保障猪瘟细胞活疫苗的质量势在必行。

1 材料与方法

1.1 试验用材料 BVDV O regon C24V株(cvcc AV 69,F5)、BVDV NADL 株(cvcc AV 67)及猪瘟兔化弱毒株(cvcc AV 1412)、BT细胞由中国兽医药品监察所菌种室提供,健康牛睾丸细胞为乾元浩北京生物制品厂张万林博士惠赠;待检猪瘟细胞苗为2008年从10个生物制品厂家抽检的样品,共计23个批次。

1.2 BVDV RT-PCR方法的建立

1.2.1 引物设计与合成 参考GenBank中BVDV O regon C24V(AF091605)和 HCLV(AF531433)序列,设计了一对能够鉴别BVDV与HCLV的引物,扩增长度为470 bp,由上海英骏生物技术有限公司合成,用水稀释至50 pm ol/μL。

1.2.2 RNA提取及合成cDNA 用T rizol裂解法提取BVDV Oregon C24V株RNA,按说明书进行,RNA模板用12μLDEPC水稀释,然后按SSTⅢ反转录酶(Invitrogen)说明书进行反转录,获得cDNA。

1.2.3 PCR反应体系的建立 对PCR反应的退火温度、引物浓度及dNTP浓度等进行初步优化后确定反应体系。

1.2.4 RT-PCR特异性试验 对BVDV Oregon C24V株、NADL株、Oregon C24V与 HCLV株混合样品、HCLV株、牛睾丸细胞培养物等进行RTPCR并凝胶电泳,对470 bp大小的PCR产物进行测序鉴定。

1.3 猪瘟细胞苗中BVDV的检测 用无菌水按1 mL/20头份量将23个批次的疫苗分别稀释,12 000 r/min离心30 min,取上清提取RNA,cDNA的合成和PCR过程按1.2进行,凝胶电泳检测,对阳性样本进行序列测定。

1.4 猪瘟细胞苗中 BVDV的序列比对 用DNAStar软件包对序列进行比对,分析BVDV毒株的基因型。

1.5 猪瘟细胞苗中污染BVDV在BT细胞中的增殖 将检测出BVDV污染的疫苗批次接种BT细胞,用含 5%FBS的 MEM 培养基在37℃、5%CO2条件下维持培养,观察细胞生长情况。

2 结果

2.1 BVDV RT-PCR检测方法的建立

2.1.1 RT-PCR反应条件 通过条件初步优化,确定反应体系为：上、下游引物工作浓度均为 0.6 pmol/μL,dNTP(each)浓度为 200 μmol;反应程序为：94℃3 min,94℃40 s,59℃40 s,72℃35 s,40个循环,72℃延伸10m in。

2.1.2 RT-PCR特异性试验 用本文建立的RTPCR方法能检测出Oregon C24V株和NADL株,扩增出470 bp大小的条带,与理论值相符;而 HCLV株和牛睾丸细胞对照没有扩增出条带(图1),将PCR产物测序后,与Oregon C24V株(AF091605)和NADL株(M 31182)进行比对,证明为BVDV Oregon C24V株和NADL株的特异序列。

图1 不同样本的PCR产物电泳结果

2.2 猪瘟细胞苗中污染BVDV的检测 用建立的方法将23个批次的猪瘟细胞苗进行BVDV检测,电泳后发现1、11、12、23、24号疫苗有阳性扩增(图略)。BVDV污染率为5/23=21.74%。

2.3 猪瘟细胞苗中污染BVDV在BT细胞中的增殖 将BVDV阳性疫苗稀释后离心取上清接种BT细胞,在培养5 d后细胞体积增大,边缘不整齐,胞浆中出现典型小空泡CPE,呈葡萄状排列。而健康细胞形态规则,边缘整齐(图2)。

2.4 猪瘟细胞苗中污染BVDV的序列比对 用DNAStar进行序列分析,证实污染的BVDV毒株全部为 BVDV I型,与 BVDV O regon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性为83.2%～83.5%,与NADL株(M 31182)的核苷酸相似性为86.4%～86.7%(图3)。

3 讨论与小结

在我国控制猪瘟采取的是强制免疫措施,但猪场中经常发生一些不明原因的猪瘟免疫失败现象,除了免疫程序、母源抗体干扰、猪瘟病毒持续感染等因素外,还可能与猪瘟疫苗污染BVDV而导致BVDV感染有关。Carbrey E A等观察到母猪感染BVDV的症状为屡配不孕、产仔数下降和流产[6],经胎盘感染的仔猪可在出生后产生BVDV抗体,也有可能形成持续性感染,并且可将BVDV传播给易感的母猪。但也有报道猪感染BVDV后产生的免疫反应能抵抗CSFV的传播[7]。

目前猪瘟细胞苗生产中对BVDV病原的检测方法主要有细胞培养、CSFV/BVDV/PPV三价荧光染色及其抑制试验等,但这些方法在实际工作很难将CSFV和BVDV进行区分,不利于生物制品原材料的快速检测。猪瘟原代细胞苗在生产过程中要用到牛血清、牛睾丸等牛源产品,原材料中若带有低滴度的BVDV,就极易造成猪瘟细胞苗污染,荷兰Wensvoort G等报道由于疫苗污染引起了8起猪的BVDV感染[1]。近几年来猪瘟细胞苗质量不稳定,如滴度偏低,收次减少等,是否与细胞带有低滴度的BVDV有关?为解决这些问题,有必要用更加敏感快速的方法来检测BVDV。同时,使用传代细胞替代原代细胞,用物理方法除去血清中污染的外源病原,可有效解决活疫苗中病原污染问题。宁宜宝等在这方面的研究已取得较大进展。中国兽医药品监察所和广东永顺联合研制的猪瘟疫苗传代细胞生产工艺已获准田间试验。

PCR方法作为一种分子诊断技术,具有常规诊断方法不可比拟的优点。近年来国内外也建立了一些检测BVDV的PCR和核酸探针方法,对于牛源BVDV的诊断有良好的效果。但对于猪源BVDV和CSFV的鉴别诊断仍然不足。本研究通过对GenBank中BVDV毒株序列和CSFV毒株序列的综合考虑,建立了一种特异性强、能够区分HCLV和基因I型BVDV的PCR方法。通过对23批猪瘟细胞苗进行PCR检测,发现有5批污染BVDV,污染率为21.74%。且全部为BVDV I型,与BVDV Oregon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性为83.2%～83.5%,与NADL株(M 31182)的核苷酸相似性为86.4%～86.7%。这种污染是否会导致猪瘟疫苗免疫失败、猪体感染及持续带毒?值得行业者共同关注。

本研究中引物设计是针对BVDV-I型的,猪瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型污染尚不清楚。需用多种方法进行检测才能全面了解猪瘟活疫苗的具体污染情况。通过本研究建立的PCR方法能区分BVDV和HCLV,可用于猪瘟细胞苗生产中的质控,以及猪群感染BVDV-I型情况的调查。

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[3] 王新平,涂长春,李红卫,等.从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒[J].中国兽医学报,1996,16(4)：341-345.

[4] 谢西锋,崔保安.牛病毒性腹泻的研究概况[J].中国兽医杂志,2001,37(11)：29.

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[6] Carbrey E A,Stew artW C,K resse J I,eta l.Natural infection of pigsw ith bovine viral diar rhea virus and its differential diagnosis from hog cholera[J].J Am Vet Med Assoc,1976,169(11)：1217-1219.

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