那可丁对人胰腺癌BxPC3细胞中HIF-1α及其靶基因VEGF表达的影响

2010-11-24 01:26张翠芳赵秋柯晓煜廖宇圣
中华胰腺病杂志 2010年2期
关键词:依赖性胰腺癌常规

张翠芳 赵秋 柯晓煜 廖宇圣

那可丁对人胰腺癌BxPC3细胞中HIF-1α及其靶基因VEGF表达的影响

张翠芳 赵秋 柯晓煜 廖宇圣

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是一种在哺乳动物组织中广泛存在的转录因子,它可诱导VEGF 转录活性的增强和表达增加,在肿瘤细胞的能量代谢、血管生成、促进肿瘤增殖和转移中起重要作用[1]。因此,抑制HIF-1α可能作为恶性肿瘤治疗的一个靶点。那可丁(noscapine)是一种阿片类生物碱。最新研究发现,那可丁能阻断HIF-1α的表达。此外,它还有抗血管形成的作用[2]。本实验观察不同浓度的那可丁在氯化钴(CoCl2)诱导缺氧的状态下对人胰腺癌细胞株BxPC3细胞中HIF-1α、VEGF基因表达的影响,探讨那可丁作为新的化疗药物治疗胰腺癌的可行性。

一、材料和方法

1.细胞培养及分组:人胰腺癌BxPC3细胞购于中科院上海细胞库。常规培养传代后分常规培养组,缺氧培养组,50、100、150 μmol/L那可丁处理组。缺氧培养是在5 ml含3%胎牛血清培养基中加入0.1 mol/L CoCl2(Sigma公司)母液12.5 μl,在常规培养条件下培养。那可丁处理组是在培养基中加入不同浓度那可丁及CoCl2后常规培养。24 h后采用Trizol一步法提取各组总RNA,用裂解液提取细胞总蛋白。

2.细胞HIF-1α、VEGF mRNA检测:采用RT-PCR方法。HIF-1α上游序列5′-GATGTAATGCTCCCCTCAC-3′,下游序列5′-GCTGGAATACTGTAACTGTGC-3′,扩增片断514 bp;VEGF上游序列5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′,下游序列5′-CAGGCCCTCTTCTCATGGTA-3′,扩增片断402 bp;内参β-actin上游序列5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游序列5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′,扩增片断157 bp。引物由上海Sangon生物工程有限公司合成。先逆转录合成cDNA,再行PCR。反应条件:94℃ 3 min,94℃ 45 s,59℃ 45 s,72℃ 45 s,31个循环,72℃延伸10 min。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)扫描,以目的条带与内参条带光密度值之比作为mRNA相对表达量。

3.细胞HIF-1α、VEGF蛋白检测:采用Western blotting方法。鼠抗人HIF-1α单抗(Abcam公司)1∶ 300稀释,兔抗人VEGF多抗和鼠抗人β-actin多抗(Bioscience公司)均1∶100稀释,HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG 1∶3000稀释,最后ECL显色,暗房曝光,洗片。

二、结果

1.细胞HIF-1α、VEGF mRNA表达的变化:常规组、缺氧组和50、100、150 μmol/L那可丁组HIF-1α mRNA相对表达量分别为0.39±0.07、1.01±0.06、1.03±0.06、1.02±0.04、0.99±0.08,CoCl2缺氧组细胞HIF-1α mRNA的表达明显高于常规组(Plt;0.05),而那可丁组细胞HIF-1α mRNA的表达与缺氧组比较无明显变化(图1)。

常规组、缺氧组和50、100、150 μmol/L那可丁组VEGF mRNA相对表达量分别为0.65±0.04、0.94±0.04、0.63±0.04、0.45±0.04、0.21±0.05。缺氧组VEGF mRNA表达明显增加(Plt;0.05),那可丁组VEGF mRNA的表达呈剂量依赖性明显下降(Plt;0.05),且100、150 μmol/L那可丁组的VEGF mRNA表达还明显低于常规组(Plt;0.05,图1)。

2.细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达的变化:常规组、缺氧组和50、100、150 μmol/L那可丁组HIF-1α蛋白相对表达量分别为0.08±0.03、0.81±0.04、0.54±0.05、0.38±0.04、0.15±0.03,缺氧组细胞HIF-1α蛋白的表达明显高于常规组(Plt;0.05),而可丁组HIF-1α蛋白表达呈剂量依赖性降低(图2)。

常规组、缺氧组和50、100、150 μmol/L那可丁组VEGF蛋白相对表达量分别为0.40±0.02、0.79±0.04、0.63±0.05、0.26±0.04、0.13±0.04,缺氧组VEGF蛋白表达明显增加(Plt;0.05),而那可丁组VEGF蛋白的表达呈剂量依赖性明显下降(Plt;0.05,图2)。

图1各组细胞HIF-1α mRNA(上)、VEGF mRNA(中)和β-actine mRNA(下)的表达

图2各组细胞HIF-1α蛋白(上)、VEGF蛋白(中)和β-actine 蛋白(下)的表达

讨论氧平衡是哺乳动物维持正常生长发育和代谢的基础,是维持细胞生存的重要因素。许多实体肿瘤具有缺氧的微环境。HIF-1α是在缺氧的细胞核提取物中发现的一种DNA结合蛋白,是介导细胞对缺氧的微环境进行适应反应的关键性转录调控因子,由α亚单位和β亚单位构成,分别位于人类第14号染色体q21224区和第1号染色体的q21区,其中α亚单位被认为是特异性氧调节亚单位,决定HIF-1α的活性[3]。不同的肿瘤组织中,致癌基因多可通过HIF-1α表达升高上调VEGF的表达,诱导新生血管形成,促进肿瘤的生长[4-6]。

那可丁一直在人体中被作为没有已知毒性作用的口服镇咳药[7-8]。有研究显示,那可丁属于植物代谢产物中的苄基异喹林类和(或)微管结合剂,是一个新HIF-1途径小分子抑制剂[9-10]。用那可丁干预经缺氧剂CoCl2处理的人类神经胶质瘤U87MG和T98G细胞系,可抑制HIF-1α的表达。其机制可能抑制HIF-1α在核内的积累以及通过蛋白酶体使它降解。微管结合剂的一个功能是它们与内皮小管结合发挥抗血管形成的活性。本实验结果表明,那可丁对HIF-1α mRNA的表达无明显影响,但可明显抑制HIF-1α蛋白水平的表达,并且这种抑制作用与药物浓度显著相关,说明那可丁是在转录水平上调控HIF-1α蛋白的表达。本实验结果还显示,那可丁呈浓度依赖性抑制VEGF mRNA和蛋白的表达。由于那可丁对人体无毒性作用,可能为恶性肿瘤的靶向治疗提供新的靶点。

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2009-03-06)

(本文编辑:屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.022

435000 湖北黄石,黄石市中心医院肝病科(张翠芳);华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科(赵秋、柯晓煜);武汉市中心医院消化内科(廖宇圣)

赵秋,Email:Tongji146@sina.com

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