异噻唑啉酮类化合物对三角褐指藻的抑制效应

杨翠云,夏传海,刘苏静,周世伟 (中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003)

海洋生物污损是指海洋微生物、植物和动物附着在海洋人工设施上造成的危害.藻类是海洋生态系统中的重要初级生产者,是形成污损生物的基础.此外,近年来频繁暴发的赤潮的起因也往往与藻类增殖密切相关.三角褐指藻即是一种常见的赤潮藻类,为保证海洋生态系统的可持续发展,开发具有抑制微藻生长的防污剂势在必行.

异噻唑啉酮类化合物是指含有异噻唑啉酮环的系列化合物的总称,是一种较新的有机除藻剂. 其对真菌、细菌、藻类均有较强的杀灭性,具低毒、高效和在水中易降解的特点[1-2].被广泛应用于杀菌、调节植物生长、海洋防污等领域[3-5].值得关注的是,该类化合物对于海洋赤潮的防治也有明显效果[6-7].基于此,作者选取三角褐指藻为模式藻种,研究异噻唑啉酮类化合物 BIT(1,2-苯并异噻唑啉-3-酮)及其类似物 X(N-丙酰基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮)对三角褐指藻生长的抑制效应,比较其对藻类的抗污效果,以期为防污剂的研制开发提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

实验用藻株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)来自中国科学院海洋研究所. 海水取自天然海水,经脱脂棉过滤后,再用 0.45μm 醋酸纤维滤膜过滤,121℃高温高压灭菌20min后用作藻类培养.在三角玻璃瓶中,添加 f/2配方的营养盐,光照强度 50μE/(m2⋅s),光暗比(L/D)=12h/12h,温度(20±1)℃条件下在恒温光照培养箱中进行培养,培养瓶每天定时摇动1次,防止贴壁生长.BIT(1,2-苯并异噻唑啉-3-酮)及其类似物 X(N-丙酰基-1,2-苯并异噻唑啉酮-3-酮),纯度均达到95%以上,可用于一般的毒理学试验.

1.2 方法

1.2.1 抑藻试验 取对数生长期的三角褐指藻接种于 100mL 三角瓶中,使藻密度为1×105～2×105个/mL,加入BIT,使其终浓度分别为:0,0.5,1,1.5,2,2.5,3.0mg/L,每处理设3个平行.对X设同样浓度处理,每处理设3个平行.每天取样显微镜下计数藻细胞密度,并根据藻细胞密度计算藻细胞比生长速率,以及取样第2d和第4d的藻细胞密度比,并选取产生最大抑制效应的第4d的藻细胞密度比,进行 Logistic 曲线方程拟合,计算BIT和X的EC50值.每2d取样测定藻细胞内叶绿素及类胡萝卜素含量.

1.2.2 藻细胞密度、细胞比生长速率、细胞密度比计算 藻细胞密度计数：每天定时取出1mL均匀的培养液,用 5%甲醛固定,并在显微镜下用血球计数板计数藻细胞数量的变化.平行计数3～5 次,取平均值.

藻细胞比生长速率计算:根据藻细胞密度,依照公式 (1) 计算藻细胞比生长速率[8].

式中:μ为比生长速率,d-1;Nt1为藻细胞在 t1时刻的密度;Nt2为藻细胞在t2时刻的密度;△t为2次测定之间的时间间隔,d.藻细胞密度比计算:根据每天取样计数的藻细胞密度计算.藻细胞密度比=处理组藻细胞密度/空白组藻细胞密度.

1.2.3 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 每2d取5mL藻液 4000r/min离心 5min,弃去上清液,用95%的乙醇重新悬浮沉淀,并于 4℃冰箱提取叶绿素和类胡萝卜素.24h后,4000r/min离心5min,取上清液在紫外/可见分光光度计(UV-1810,北京普析通用仪器有限责任公司)上,于波长665,649,470nm 处测上清液的吸光度.根据Lichtenthaler和Buschmann提出的公式计算叶绿素和类胡萝卜素含量[8]:

式中: A为吸光值(波长665, 649, 470nm处), Chla为叶绿素a.

1.3 数据统计

数据采用origin 7.0软件进行差异显著性分析,P＜0.01表示差异极显著.应用 SigmaPlot for Windows Version 10.0(Systat Software Inc., USA)进行曲线方程拟合及EC50的计算.

2 结果与讨论

2.1 BIT及其类似物X对三角褐指藻生长的影响

由图1可见,2mg/L和3mg/L BIT处理对三角褐指藻具有明显的抑制作用,且在生长第4d,抑制率显著,分别为51.29%、84.76%.而0.5mg/L和1mg/LBIT处理下,细胞生长曲线与对照无明显差别,说明低浓度BIT对藻细胞生长基本没有影响.2mg/L和3mg/L的X处理对三角褐指藻具有一定的抑制作用,最明显的抑制率发生在生长第3d,分别为36.24%、45.01%.相同浓度处理下X没有BIT 的抑制作用明显,低浓度的X处理同样对三角褐指藻的生长没有明显的抑制作用.但无论是低浓度处理组还是高浓度处理组,藻细胞密度均随时间的延长而逐渐增加.总体来看,BIT或X的处理只是延长了藻细胞的延滞生长期,且处理浓度越高,效果越明显;但随着时间的延长,这种作用也越来越弱,处理组和对照组,藻细胞生长曲线均呈逐渐上升的趋势,这与文献报道的很多外源性物质对藻类的胁迫作用相似[9-11].研究表明,鼠李糖等表面活性剂或杀藻剂对多种海洋藻类包括中肋骨条藻、新月菱形藻、旋链角毛藻等具有一定的抑制效应,但随着处理时间延长,处理组藻细胞密度均呈快速增值趋势,藻细胞生长的延滞期长短取决于外源性物质的浓度高低.本实验中同时发现,在高浓度BIT处理下,最初培养液中会出现白色沉淀,显微镜观察推测可能是藻细胞死亡的残体,未死亡的藻细胞经过一段时间适应之后逐渐增殖,使其度过外源性化合物的胁迫期,呈现从被动适应到主动适应的过程.

图1 不同浓度BIT和X处理对三角褐指藻生长的影响Fig.1 Effect of BIT and X on the growth of Phaeodactylum tricornutum

细胞比生长速率与藻细胞密度比可以进一步评价外源性物质对藻细胞生长的影响.从图2可以看出,3mg/L的BIT处理组,藻细胞比生长速率显著低于对照组(P＜0.01),说明高浓度 BIT处理能显著抑制藻细胞的生长;2mg/L的BIT处理,藻细胞比生长速率略微低于对照,但经统计检验没有达到显著水平;而低浓度(0.5,1mg/L)BIT处理,细胞比生长速率与对照几乎没有差异.同样,X的低浓度处理组(0.5,1mg/L)细胞比生长速率和对照也无明显差异,而高浓度X处理组(2,3mg/L),细胞比生长速率低于对照,说明高浓度的X处理能够抑制藻细胞的生长,但这种抑制作用没有达到显著水平.

图2 不同浓度BIT和X处理对三角褐指藻细胞比生长速率的影响Fig.2 Effects of BIT and X on the specific growth rate of Phaeodactylum tricornutum

同样,选取第2d和第4d的藻细胞密度比来评价BIT和X对三角褐指藻生长的抑制效应,图3可以看出,随着BIT处理浓度的增加,培养第2d和第4d的藻细胞密度比明显降低,并且在3mg/L的处理浓度下,第4d的藻细胞密度比显著低于第2d的藻细胞密度比,说明高浓度的BIT能显著抑制藻细胞的生长. X对三角褐指藻的处理第2d和第4d的藻细胞密度比同样随处理浓度的升高而显著下降(P＜0.01),但第2d和第4d相比藻细胞密度比没有显著差异,说明高浓度X的处理没有随时间的延长表现出对三角褐指藻有更明显的抑制效应.藻细胞密度比对BIT和X的响应正好和藻细胞的比生长速率相对应,高浓度的BIT显著抑制藻细胞的生长而X对藻细胞的生长具有一定的抑制效应但均没有达到显著水平.

图3 不同浓度BIT和X处理对三角褐指藻细胞密度比的影响Fig.3 Effects of BIT and X on the cell density ratio of Phaeodactylum tricornutum

选取最大抑制(接种4d)时的样品,探讨 BIT和X对三角褐指藻生长的抑制效应.以对照中三角褐指藻密度为100%,计算各提取液处理下三角褐指藻相对密度,得到提取液对三角褐指藻生长的抑制曲线(图4).运用Logistic曲线方程拟合,即可获得BIT和X的96h半效应质量浓度(EC50)分别为1.95mg/L(R2=0.988, P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279). EC50值的差异进一步证实BIT对三角褐指藻的抑制作用比X对藻的抑制作用强.除本实验研究的三角褐指藻之外,国内江涛等[12]研究也发现,异噻唑啉酮对湛江球形棕囊藻、海洋单细胞藻和棕榈藻均有较强的杀灭作用.而Willingham 等[13]指出,异噻唑啉酮类似物 Sea-Nine211防污剂对Enteromorpha藻和硅藻 Amphora coffeaeformis具有较强的杀灭作用,半数致死量LD50分别为0.002mg/L和0.003mg/L,远远低于本研究的EC50值,这可能是由于外源性化合物对藻类的胁迫效应具有种类特异性[9],并且和实验初期藻细胞起始密度具有一定关系.Hong等[14]曾报道,EMA(2-甲基-乙酰乙酸乙酯)对绿藻 Selenastrum capricornutum的生长、生理胁迫反应和藻细胞的初始密度密切相关.同样的结果也出现在其他文献[15-16]报道中,藻类的起始密度或藻类的不同生长期加入外源性物质,藻类受到的胁迫反应大小不同,或者说恢复正常生长达到对数期的时间不同.

图4 不同浓度BIT和X处理对三角褐指藻的抑制效应Fig.4 Inhibitory effect of BIT and X on Phaeodactylum tricornutum

2.2 BIT及其类似物X对三角褐指藻细胞色素含量的影响

藻细胞色素含量是藻类生长特征的表征参数,是藻生物量的一种反映,同时也是藻进行生长光合作用的重要物质基础,色素含量可以反映藻类生长状况和藻类的光合作用利用效率[17].由图5可见,三角褐指藻生长 3d时,低浓度0.5mg/L的BIT对藻细胞内叶绿素和类胡萝卜素含量均没有明显影响;而1mg/L的BIT处理3d显著降低了细胞内叶绿素含量(P＜0.01)和类胡萝卜素含量(P＜0.05),分别降低了 21.85%和21.09%;高浓度 BIT(2mg/L 和3mg/L)处理 3d,细胞内叶绿素分别降低53.09%、88.91%,类胡萝卜素含量分别降低54.42%、90.02%,均达到极显著水平(P＜0.01).藻细胞经过处理7d时,只有3mg/L的BIT处理组细胞内叶绿素和类胡萝卜素含量显著低于对照(P＜0.05),分别降低53.8%、58.71%,而其他处理组和对照相比均没有明显变化,说明随着处理时间的延长BIT引起的藻细胞的胁迫效应逐渐减弱,这和藻细胞生长抑制曲线结果类似.随着时间的延长,藻细胞生长密度逐渐增加,恢复生长.而X对藻细胞内色素含量的影响只有在高浓度3mg/L处理7d时细胞内叶绿素含量降低30.51% (P＜0.01),而类胡萝卜色素含量在处理3d、7d时均显著降低,分别降低 51.18%、31.04%.BIT和X对藻细胞内色素含量的影响结果显示,异噻唑啉酮类化合物能够抑制藻细胞内色素含量,进而影响藻细胞的光合作用效率,影响藻的生长.以前的研究报道表明,外源性物质对藻的抑制机理主要在4个方面:破坏藻细胞结构,改变藻的光合、呼吸以及细胞内酶的活性.Yang等[16]报道外源性物质EMA能诱导细胞内一系列酶和非酶物质的改变抵抗外界胁迫,并发现 EMA能抑制细胞内色素含量,改变色素比例,这可能是藻类适应逆境胁迫的策略.在本研究中,发现BIT和X能够抑制藻细胞的色素含量,说明其光合作用受到抑制,但随处理时间延长,抑制作用减弱.这说明:藻细胞数量的增加抵抗了胁迫,这和外源性物质对藻的抑制效应随细胞起始密度增加而减弱相呼应[14,18].

图5 不同浓度BIT和X处理对三角褐指藻细胞色素含量的影响Fig.5 Effects of BIT and X on the pigment contents of Phaeodactylum tricornutum

细胞色素含量的增加提高了藻的光合作用,而外源性物质的浓度只可能不变或减少,因此藻细胞逐渐适应并抵抗了外界胁迫.本研究同时确认, BIT比X具有更好的抑藻效果,具有更低的EC50值,在海洋防污剂开发中有更好的的应用前景.但在实际应用中,还应该考虑其在环境中的迁移转化及其可能存在的生态安全性,防止类似于四丁基锡(TBT)类防污剂广泛应用后带来的生态灾害问题发生,关于BIT对其它污损生物的防污效果及其环境归宿还需要更进一步深入系统研究.

3 结论

3.1 异噻唑啉酮类化合物对三角褐指藻的生长、比生长速率、细胞密度比结果均显示,BIT和X在高浓度下对三角褐指藻均具有一定的抑制效应,能增加藻细胞生长的延滞期,但这种抑制作用均会随着处理时间的延长而减弱,藻细胞逐渐恢复快速增殖,BIT的抑制效应优于X.

3.2 BIT和X能够降低三角褐指藻细胞内色素含量,BIT在处理3d时,较低浓度(1mg/L,2mg/L)和高浓度(3mg/L)均能降低细胞内叶绿素和类胡萝卜素含量,但处理7d时只有高浓度能够降低色素含量,而X在整个处理时间内只有高浓度能够降低细胞色素含量.

3.3 BIT和X对藻的96h半效应质量浓度(EC50)分别为1.95mg/L(R2=0.988,P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279),EC50值的差异进一步说明BIT比X对三角褐指藻的抑制作用强.

[1]Jacobson A H, Willingham G L. Sea-Nine antifoulant: anenvironmentally acceptable alternative to organotin antifoulants[J]. The Science of the Total Environment. 2000,258(1):103–110.

[2]Fern’andez-Alba A R, Hervando M D, Piedra L, et al. Toxicity evolution of single and mixed antifouling biocides measured with acute toxicity bioassays [J]. Analytica Chimica Acta. 2002,456(2):303-312.

[3]张春燕,于良民,张志明.异噻唑啉酮类化合物的降解及生态毒理行为研究进展 [J]. 上海涂料, 2008,46(11):34-37.

[4]Dobretsov S, Dahms H U, Qian P Y. Inhibition of biofouling by marine microorganisms and their metabolites [J]. Biofouling,2006,22(1):43–54.

[5]于良民,姜晓辉,董 磊,等.异噻唑啉酮类化合物及其在海洋防污涂料中的应用 [J]. 涂料工业, 2004,34(5):43-48.

[6]洪爱华,尹平河,赵 玲,等.碘伏和异噻唑啉酮对球形棕囊藻去除的研究 [J]. 应用生态学报, 2003,14(7):1177-1180.

[7]Humphries S E, Widjaja F. A simple method for separating cells of Microcystis aeruginosa for counting [J]. British Phycological Journal, 1979,14:313-316.

[8]Lichtenthaler H K, Buschmann C. Chlorophylls and carotenoids:measurement and characterization by UV-VIS spectroscopy [M].In: J Wiley and Sons, Editors, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001,p.F4.3

[9]龚良玉,王修林,李雁宾,等.鼠李糖脂对硅藻生长的影响及其选择性抑藻作用 [J]. 中国环境科学, 2006,26(1):96-100.

[10]Wang X L, Gong L Y, Liang S K, et al. Algicidal activity of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa[J]. Harmful Algae, 2005,4(2):433-443.

[11]李志斐,谢 骏,龚望宝,等.三甲基氯化锡对水生生物的毒性效应 [J]. 中国环境科学, 2011,31(4):642-646.

[12]江 涛,江天久,李 鹏,等.湛江球形棕囊藻赤潮除藻试验 [J].热带亚热带植物学报, 2006,14(1):14-18.

[13]Willingham GL, Jacobson AH. Efficacy and environmental fate of a new isothiazolone antifoulant [C]// The proceedings of the third Asia-Pacific conference of the paint research association.Teddington, UK: International Centre for Coatings Technology,1993,14.1-14.13

[14]Hong Y, Hu H Y, Li F M. Growth and physiological responses of freshwater green alga Selenastrum capricornutum to allelochemical ethy 2-methyl acetoacetate (EMA) under different initial algal densities [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology,2008,90:203-212.

[15]Franklin N M, Stauber J L, Apte S C, et al. Effect of intial cell density on the bioavailability and toxicity of copper in microalgal bioassays [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2002,21:742-751.

[16]Men Y J, Hu H Y, Li F M. Effects of the novel allelochemical ethyl 2-methylacetoacetate from the reed (Phragmitis australis Trim ) on the growth of several common species of green algae[J]. Journal of Applied Phycology, 2007,19:521-527.

[17]Geoffroy L, Frankart L C, Eullafroy E. Comparison of different physiological parameter responses in Lemna minor and Scenedesmus obliquus exposed to herbicide flumi oxazin [J].Environmental Pollution, 2004,131:233-241.

[18]Yang C Y, Liu S J, Zhou S W, et al. Allelochemical ethyl 2-methyl acetoacetate (EMA) induces oxidative damage and antioxidant responses in Phaeodactylum tricornutum [J].Pesticide Biochemistry and Physiology, 2011,100: 93-103.