车前子环烯醚萜苷类化合物与其抑制PTP1B的活性研究

崔龙, 李志, 孙亚楠, 张南

(1.北华大学药学院,吉林132013;2.中国石油吉林石化公司,吉林132021)

车前子环烯醚萜苷类化合物与其抑制PTP1B的活性研究

崔龙1, 李志2, 孙亚楠1, 张南1

(1.北华大学药学院,吉林132013;2.中国石油吉林石化公司,吉林132021)

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B在胰岛素信号传达过程中起负调控作用,也是研究治疗2型糖尿病的重要靶点.利用生物活性导向分离方法从车前子中分离得到6个环烯醚萜苷类活性化合物.通过光谱和文献比较鉴定,6种化合为Desacetylhookerioside(1),Hookerioside(2),A lpinoside(3),Majo roside(4),Anagalloside(5)和10-hydroxymajoroside(6),其中化合物3和5可以有效抑制 PTP1B的活性,其 IC50值分别为(17.7±2.5)和(19.8±1.2)μM.

车前子;环烯醚萜苷;蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B

0 引言

2型糖尿病是一种常见的代谢紊乱疾病,其特征是外周对胰岛素产生抵抗作用,在分子水平表现为胰岛素与胰岛素受体结合后信号转导缺失.蛋白酪氨酸的磷酸化水平是细胞内信号转导的重要调节因素,它由蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)共同调控[1].近年研究发现,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)可以去磷酸化蛋白酪氨酸,在胰岛素信号转导通路中起着重要的负调控作用[2].敲除PTP1B基因[3-4],或运用反义核苷酸(ASO)抑制体内 PTP1B蛋白和m RNA的表达[5],不仅可以显著提高受试小鼠对胰岛素的敏感性,而且能明显降低肥胖症的患病

几率.这些研究表明,PTP1B有可能成为治疗2型糖尿病的新靶点.因此,对小分子 PTP21B抑制剂的研究已成为近年来胰岛素增敏剂研究的热点之一[6].

车前子为车前科植物车前Plantagoasiatica L的干燥成熟种子[7],具有清热利尿、明目祛痰的功效.现代研究证明,车前子还具有致泄、护肝、降压、血清胆固醇等多种药理作用,主要用于治疗各种便秘、肥胖症等[8].目前,从这种植物中已经分离出类黄酮和环烯醚萜苷类等化合物,并且证实了这些化合物的抗氧化和抗微生物等活性[9-10].关于车前子的成分研究虽然比较多,但是其成分与抑制 PTP1B活性方面的研究仍处于空白状态,本论文首次报道了从车前子中筛选 PTP1B抑制剂,并进行了构效方面的比较研究.

1 实验材料和方法

1.1 仪器、试剂及材料

1H,13C-NMR用 INOVA-500 MHz型核磁共振仪(美国 CIL公司,TMS为内标);MS用QSTAR质谱仪;EL ISA酶标仪(美国);反相薄层色谱板(Rp-18 F254)为Merck公司产品;反相柱色谱用硅胶ODS为Nacalai Tesque公司产品;大孔CHP-20为 Pharmacia公司产品;所用试剂均为分析纯(国药集团).

车前子于2008年10月采于吉林省白山市长白山周边地区,经过专家鉴定为PlantagoasiaticaL.标本收藏于北华大学药学院药物化学实验室(标号为:CQZ 20081003).

1.2 提取和分离

取车前子500 g,用5 L甲醇溶液室温浸泡,连续浸泡3次,每次24 h.合并提取液,然后减压浓缩甲醇提取液,回收甲醇.将浓缩提取物用适量水混悬,依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取.可溶于正丁醇的部分(IC50=30.2μg/mL,105.0 g)用反相(RP-18)色谱柱(10×30 cm,40～63μm)分离,以水-甲醇(体积比为100∶1至1∶1)梯度洗脱,洗脱馏分根据薄层板点板情况合并相同部分,共分为5个组分.组分5经硅胶色谱柱(10×30 cm,75～150μm)分离,以水-甲醇(体积比为70∶1至50∶1)梯度洗脱,所得馏分再经过CHP-20柱色谱纯化,流动相为水-甲醇(体积比为50∶1至 1∶1),分别得到纯的化合物 1(16.0 mg,0.03%),化合物 2(11.0 mg,0.03%),化合物3(15.0mg,0.05%),化 合 物 4(7.0 mg,0.09%),化合物 5(9.0 mg,0.1%),化合物6(7.0mg,0.1%).

图1 化合物1-6的化学结构式

1.3 抑制PTP1B活性的试验

PTP1B酶购至于 B IOMOL公司.放入 2 mmol对硝基苯基磷酸、PTP1B酶和含有 50 mmol柠檬酸、0.4mmol NaCl、2mmol EDTA 和2mmol DTT的缓冲液,在30℃下保温45 min,最后用1 mmol NaOH终结反应,通过测量其在410 nm的吸收值变化,计算出其抑制率.

2 结构鉴定

化合物1为白色粉末.ESI-MSm/z:535[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.60(s,H-3),6.30(s,H-1),5.59(d,J=8.0 Hz,H-1″),4.85(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.32(d,J=12.0 Hz,H-10a),4.20(d,J=12.0 Hz,H-10b),2.49(m,3H,CH2-7 and H-6a),1.48(m,H-6b);13C-NMR (100 MHz,D2O):δ168.2(C-11),154.2(C-3),143.8(C-8),130.0(C-9),113.2(C-4),99.3(C-1′),94.6(C-1″),92.6(C-1),77.5(C-5″),77.0(C-5′),76.5(C-3′),76.3(C-3″),73.5(C-2′),72.9(C-2″),70.2(C-4′),70.1(C-4″),61.7(C-6″),61.4(C-10),61.2(C-6′),37.8(C-5),35.8(C-7),31.5(C-6).Compound 1通过文献比较确定为Desacetylhookerioside[11].

化合物2为白色粉末.ESI-MSm/z:577[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.48(s,H-3),6.24(s,H-1),5.47(d,J=8.0 Hz,H-1″),4.82(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.42(d,J=12.0 Hz,H-10a),4.23(d,J=12.0 Hz,H-10b),2.46(m,3H,CH2-7 and H-6a),2.06(s,CH3CO-),1.46(m,H-6b);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ173.6(CH3CO-),167.3(C-11),153.5(C-3),143.6(C-8),130.3(C-9),113.4(C-4),99.5(C-1′),94.3(C-1″),92.4(C-1),76.9(C-5″),76.5(C-5′),74.5(C-3′),73.3(C-3″),73.1(C-2′),72.8(C-2″),70.6(C-4′),70.5(C-4″),61.5(C-6″),61.3(C-10),61.1(C-6′),36.8(C-5),34.8(C-7),31.4(C-6),20.2(CH3CO-).Compound 2通过文献比较确定为Hookerioside[12].

化合物3为白色粉末.ESI-MSm/z:415[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.06(s,H-3),6.22(s,H-1),4.80(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.75(m,10-CH2),2.48(m,3H,CH2-7 and H-6a),2.06(s,CH3CO-),1.47(m,H-6b);13C-NMR (100 MHz,D2O):δ174.6(CH3CO-),168.5(C-11),146.6(C-3),137.4(C-8),133.4(C-9),119.2(C-4),99.8(C-1′),91.8(C-1),77.2(C-5′),76.3(C-3′),73.4(C-2′),70.3(C-4′),61.6(C-10),61.4(C-6′),39.3(C-5),34.2(C-7),31.2(C-6),21.3(CH3CO-).化合物3通过文献比较确定为A lpinoside[11].

化合物4为白色粉末.ESI-MSm/z:402[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.03(s,H-3),6.20(s,H-1),4.82(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.48(m,H-6a),3.42(s,CH3O-),1.47(m,H-6b),1.33(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.3(C-11),146.4(C-3),137.2(C-8),133.5(C-9),119.6(C-4),99.7(C-1′),91.9(C-1),77.3(C-5′),76.4(C-3′),74.1(C-7),73.3(C-2′),70.1(C-4′),61.2(C-6′),52.9(CH3O-),39.2(C-5),31.4(C-6),11.1(CH3-).化合物4通过文献比较确定为Majoroside[12].

化合物5为白色粉末.ESI-MSm/z:372[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.06(s,H-3),6.23(s,H-1),4.86(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.45(m,3H,CH2-7 and H-6a),1.46(m,H-6b),1.34(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.3(C-11),146.4(C-3),137.2(C-8),133.5(C-9),119.6(C-4),99.7(C-1′),91.9(C-1),77.3(C-5′),76.4(C-3′),73.3(C-2′),70.1(C-4′),61.2(C-6′),39.2(C-5),34.8 (C-7),31.4 (C-6),11.7(CH3—).化合物5通过文献比较确定为Anagalloside[13].

化合物 6为白色粉末.ESI-MSm/z:418[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.05(s,H-3),6.23(s,H-1),4.80(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.45(m,H-6a),3.40(s,CH3O-),1.48(m,H-6b),1.37(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.5(C-11),146.1(C-3),137.3(C-8),133.2(C-9),119.4(C-4),99.5(C-1′),91.7(C-1),77.4(C-5′),76.6(C-3′),74.12(C-7),73.4(C-2),70.0(C-4′),66.8(C-10),61.4(C-6′),52.6(CH3O —),39.6(C-5),31.6(C-6).化合物6通过文献比较确定为10-hydroxymajo roside[12].

3 结果与讨论

通过体外PTP1B活性检测平台,测定6个化合物对PTP1B的活性抑制作用,结果见表1.在活性测试中,用RK-682作为对照品.通过对已筛选出的化合物结构和活性比较,发现化合物3和5表现出显著的抑制 PTP1B活性,其 IC50值范围在(17.7±2.5)到(19.8±1.2)μm;而化合物 1、2、4和6与化合物3和5比较,显示出非常弱的抑制PTP1B活性作用.这表明化合物结构中C-11位被葡萄糖基或甲基取代能显著降低化合物抑制PTP1B活性,还说明表现出化合物4和6结构中C-7位置上的羟基对该类化合物抑制 PTP1B活性无作用;反之,C-11位置连有羧基则显著增加抑制PTP1B活性.此外,化合物3和5活性较高,这表明在结构中C-10位被乙酰基取代对其抑制PTP1B活性影响不大.

表1 化合物1-6有效抑制PTP1B活性的浓度

4 结论

本文以 PTP1B生物活性为向导,从车前子中筛选出对PTP1B有显著抑制作用的环烯醚萜苷类化合物.虽然本文对带有羧基的环烯醚萜苷类化合物的构效关系没有进行更深入的研究,但实验结果显示,被羧基取代的环烯醚萜苷类化合物,在体外对PTP1B的活性抑制起很重要作用.因此,进一步优化环烯醚萜苷类衍生物,研究其在细胞体内外中的降糖作用机理,或许能够找到潜在的用于治疗2型糖尿病和肥胖症的新的PTP1B抑制剂.

本课题部分资金来源于长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室(延边大学),在此表示衷心的感谢.

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Protein Tyrosine Phosphatase 1B Inhibitory Activity of Iridoid Glucosides Isolated from Plantago Asiatica

CU ILong1, L IZhi2, SUN Ya-nan1, ZHANG Nan1
(1.CollegeofPharmacy,BeihuaUniversity,Jilin132013,China;2.ChinaPetroleumJilinPetrochemicalCo.,Ltd.,Jilin132021,China)

Protein tyrosine phosphatase 1B p lays amajor role in the negative regulation of insulin signaling,and thus considered as an attractive therapeutic target fo r diabetes.Bioassay-guided fractionation of the seeds ofPlantagoasiaticaafforded six p rotein tyrosine phosphatase 1B inhibito ry iridoid glucosides(1-5).Six compounds were identified as Desacetylhookerioside(1),Hookerioside(2),Alpinoside(3),Majo roside(4)Alpinoside(5)and 10-hydroxymajo roside(6)by comparison of their spectral data with those in the literature.Isolated compounds 3 and 5 inhibited PTP1B with IC50values ranged from(17.7±2.5)to(19.8±1.2)μM.

Plantagoasiatica;iridoid glucosides;PTP1B

R284

A

1004-4353(2011)02-0180-04

2011-05-04

教育部留学回国人员科研启动基金

崔龙(1971—),男,博士,副教授,研究方向为天然药物化学.