羊痘病毒属病毒ORF132的克隆及序列分析＊

丁 森,聂福平,王 昱,肖进文,周雪梅,肖 雯,黄 鹤,刘生峰,周 庆,李应国,蔡家利

痘病毒科(Poxiridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV)主要包括山羊痘病毒(Goatpox Virus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox Virus,SPPV)和疙瘩皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)三种[1-5]。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是羊的一种急性、热性、接触性传染病,包括绵羊痘(Sheeppox,SP)和山羊痘(Goatpox,GP)。主要表现为发热,无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生红斑、丘疹、疱疹、水泡(少数)、内脏病变(特别是肺)[6]。疙瘩皮肤病病毒引起疙瘩皮肤病(Lumpy skin disease,LSD)是以患牛发热,皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节,淋巴结肿大,皮肤水肿为特征的传染病。该病又称结节性皮炎或块状皮肤病,能引起感染动物消瘦,产乳量大幅度降低,严重时导致死亡。

GTPV和SPPV基因组约有150 kb,共有147个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。2001年美国科学家报道了LSDV的基因组序列,其基因组长145 kb～152 kb[7],基因组中没有发卡环结构,核苷酸组成中含有73%A+T,呈有规律的均匀分布。但是,三种病毒基因间的同源性非常高,如要对三种病毒进行基因水平的检测,必须找到针对三种病毒的特异性基因序列。通过全基因比对,发现三者的ORF132基因具有较好的特异性。因此对其进行克隆分析,以期对后续研究有所帮助。

1 实验材料

山羊痘病毒株;绵羊痘病毒株;疙瘩皮肤病疫苗株;疙瘩皮肤病野毒株DNA;山羊睾丸原代细胞由实验室自行制备;MEM培养基购自Invitrogen公司;链-青霉素双抗、胎牛血清购自 Thermo公司;DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司;胶回收试剂盒,载体连接试剂盒购自大连宝生物公司;JM109感受态细胞由重庆出入境检验检疫局技术中心实验室提供。引物由宝生物(大连)公司合成。

2 实验方法

2.1 病毒培养和核酸提取 15天左右的雄性羊只,绑定,处死。无菌操作下,止血钳夹住精索,剥离睾丸,去掉外层的膜,游离的睾丸,含10×双抗 PBS清洗睾丸,镊子撕去掉白色的薄膜,尽量干净,把睾丸置于小烧杯中,眼科剪刀剪碎20 min;加无血清培养液DMEM(10×双抗),用20mL针头注射器反复吹打20次,用200或300目不锈钢滤网过滤,沉淀一下,吸取上层的细胞;剩下的再吹打,过滤,吸取上层的细胞,清洗2次,3 000r/min,5min;分装,加含双抗(2×),10%胎牛血清的MEM培养基15 mL～20 mL;2～3 d后换液。待细胞长成单层后,准备接毒。弃去细胞瓶内原有培养液,无血清DMEM清洗1次;50μL种毒加450μL维持液(含2%胎牛血清,1%双抗的MEM)混匀后加入到细胞瓶中;摇晃均匀,37℃吸附1h,期间每20min摇晃一次;1h后补充4.5mL维持液;37℃CO2恒温培养箱培养,观察侵染结果。山羊痘、绵羊痘、疙瘩皮肤病病毒、阴性对照各一瓶;病变达75%以上时,收毒。取出细胞瓶,封口,置-70℃冰箱冻实后,取出室温融化,反复3次,使细胞释放病毒。取山羊痘、绵羊痘和疙瘩皮肤病病毒细胞培养液各200μL,提取DNA,进行PCR扩增,10g/L琼脂糖凝胶电泳。

2.2 基因的克隆和测序 山羊痘病毒ORF132基因 上 游 引 物 ,5′-ACAAACACTTCCCTCCTTAAGCTACT-3′,扩增位置 ,4bp-465bp;绵羊痘病毒ORF132基因上游引物,5′-GACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTAC-3′,扩增位置 ,4bp-494bp;疙瘩皮肤病病毒 ORF132基因上游引物,5′-A TGACAAA YACTTCCCTCCTTTTAAGC-3′,扩 增 位置 ,4bp-498bp;通 用 下 游 引 物 ,5′-ATCTCCATGNGAAACTTTACAAA-3′。PCR体系:10×PCR Buffer 2.5μL,2.5 each mmol/L dN TP Mix 1μL;25 mmol/LMgCl22μL,Taq 聚 合 酶 (5U/μL)0.4μL,上 游 引 物 (10μmol/L)1μL,下 游 引 物(10μmol/L)1μL,DNA 模版 5μL,补充灭菌蒸馏水至25μL。反应条件:95℃预变性 5min,95℃变性40s,50℃退火1min,72℃延伸 1min,进行 35个循环;72℃补充延伸8min。将 GTPV、SPPV及LSDV的PCR产物连接于19-T载体并转化入JM109感受态细胞,选取PCR鉴定阳性的克隆质粒各两个,送至大连宝生物公司进行测序。

2.3 序列分析 利用相应软件对测序基因进行同源性分析。

3 实验结果

3.1 接种三种病毒后山羊睾丸细胞病变图 细胞贴壁的过程中,细胞形态有圆形逐渐变为不规则的多边形,长梭型,呈纤维状存在。接种病毒3天后细胞病变明显:与对照组比较后发现,山羊痘病毒可使山羊睾丸细胞产生皱缩,绵羊痘病毒可使细胞出现结节状聚集和死亡漂浮,疙瘩皮肤病病毒主要使细胞出现结节状聚集。(图1,2,3)

3.2 阳性质粒PCR鉴定电泳图(图4)。

3.3 同源性分析

3.3.1 四种病毒基因比对(图5)。

3.3.2 基因网上比对 测序结果在NCBI网站进行Blast比对后发现该山羊痘病毒与山羊痘病毒G20-L KV株、Pellor株有95%的相似性;绵羊痘病毒与绵羊痘病毒A株、NISKHI株有98%的相似性与10700-99 strain TU-V02127株有 97%的相似性;疙瘩皮肤病疫苗株与isolate Neethling vaccine LW 1959株有 99%的相似性,与 NI-2490 isolate Neethling2490株、NW-LW isolateNeethling Warmbaths LW株有97%相似性;疙瘩皮肤病野毒株与NI-2490 isolate Neethling 2490株、NW-LW isolate Neethling Warmbaths LW株有99%相似性,与isolate Neethling vaccine LW 1959株有96%的相似性(图6)。

4 讨 论

羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种,发病后成羊死亡率40%,羔羊死亡率100%,有本病的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列为严格限制进出的对象,严重影响国际贸易和养羊业的发展[8-10]。中国[11-12]、瑞典、印度[13]依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道,因此,研究该病在公共卫生方面有重要意义。羊痘病毒(SGPV)还可作为生物武器,成为世界恐怖分子威胁世界和平的有力手段,被划归到Ⅱ类危险战剂。世界动物卫生组织(OIE)将该病定为法定通报疾病,我国将其列为Ⅰ类动物疫病[10,14]。疙瘩皮肤病起源于非洲,并于1989年和2006年在以色列发生,显示该病已逃逸出非洲大陆,有不断蔓延的趋势[1]。各种牛均易感,死亡率能达到3%～85%,给经济带来较大的损失。

但是,目前世界各国都还未有较为可靠的检测该属病毒的方法,使进出口检验检疫处于被动地位。为严格防止该类病的传入,尽早检出,减少损失,建立快速高效,操作简便,成本低廉的 GTPV、SPPV及LSDV检测方法迫在眉睫。

基于此,对 GenBank上公布的山羊痘、绵羊痘及疙瘩皮肤病各个开放阅读框的基因序列,进行比对后发现,ORF132基因相对于其他开放阅读框有较大的特异性,可作为目的基因建立分子生物学检测方法。可以此为特征序列设计引物进行PCR鉴定以及设计探针进行基因芯片检测该属病毒。建立一整套该属病毒的分子诊断技术平台,对满足进出境动物检疫工作的需要,控制羊痘传播,并防止牛疙瘩皮肤病由境外向我国扩散,保障我国的畜牧业健康、安全发展具有十分重要的意义。

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