RP-HPLC法同时测定大鼠血浆中的紫杉醇与汉防己甲素Δ

2011-01-24 02:43孙方迪郭涛侯悦潘昊
中国药房 2011年19期
关键词:防己甲素内标

孙方迪,郭涛,侯悦,潘昊

(1.沈阳药科大学药学院,沈阳市 110016;2.沈阳军区总医院药剂科,沈阳市 110016)

RP-HPLC法同时测定大鼠血浆中的紫杉醇与汉防己甲素Δ

孙方迪1,2*,郭涛2#,侯悦1,潘昊1

(1.沈阳药科大学药学院,沈阳市 110016;2.沈阳军区总医院药剂科,沈阳市 110016)

目的:建立同时测定大鼠血浆中紫杉醇、汉防己甲素的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。取血浆200µL,以利血平为内标,利用乙醚提取,氮气吹干,残渣用流动相溶解,进样20μL。色谱柱为Platisisl ODS(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4(30∶40∶30,磷酸调节pH值至4.5),流速为1.0mL·min-1,检测波长为227nm。结果:紫杉醇、汉防己甲素检测浓度分别在0.02~20μg·mL-1和0.02~5μg·mL-1(r分别为0.9990、0.9993)范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。紫杉醇和汉防己甲素低、中、高浓度的方法回收率分别为100.5%~104.0%和101.0%~104.8%,提取回收率分别为84.7%~93.8%和70.8%~86.0%;日内、日间精密度均<10%。结论:本方法专属性强、操作简单、结果准确,可用于紫杉醇和汉防己甲素在大鼠体内的药动学研究。

反相高效液相色谱法;紫杉醇;汉防己甲素;药动学

紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药,由于其化学结合新颖、作用机制独特,故对其开发利用被誉为20世纪90年代抗肿瘤药三大成就之一[1]。作为新型的广谱抗肿瘤药物,紫杉醇被广泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、非小细胞性肿瘤以及类风湿性关节炎的治疗[2]。现行的紫杉醇制剂(Taxol®)是将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor®EL)与无水乙醇1∶1的混合液中,给药前用0.9%生理盐水或5%葡萄糖溶液稀释[3]。紫杉醇注射剂虽已得到广泛的应用,但其仍存在稳定性、水溶性较差和严重过敏反应等诸多不足。口服给药是最方便的给药途径,而紫杉醇口服时却存在生物利用度极差的问题,难于经口服给药。文献[2]报道,由于胃肠道上皮细胞膜上存在P-糖蛋白(P-gp),导致紫杉醇被泵出肿瘤细胞,出现临床上的抗肿瘤药物多药耐药现象。本课题组以抗肿瘤药紫杉醇为模型药,配以P-gp抑制剂——汉防己甲素,意在改变目前临床抗肿瘤药物的多药耐药现象,并同时提高紫杉醇口服生物利用度,降低其不良反应,提高其临床使用率。本研究采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,首次建立了同时测定紫杉醇、汉防己甲素的定量分析方法,以期为进一步研究复方紫杉醇新制剂提供可行的检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPLC系统,包括600四元梯度泵、2487型紫外检测器(美国Waters公司);YKH-2型液体快速混合器(江西医疗器械厂);KQ3200DE型超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司);TGL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

紫杉醇(上海金杉生物科技有限公司,批号:20070720,含量:>99.8%);利血平(广东邦民制药厂,批号:20050718);汉防己甲素(西安山川生物技术有限公司,批号:20060113,含量:>99.5%);甲醇(色谱纯,天津四友公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

Wistar大鼠6只,♂,体重250~300g,由沈阳药科大学动物中心提供(动物生产合格证号:SCXK(辽)20033008)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Platisil(铂金)ODS(250mm×4.6mm,5µm);流动相:甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4(30∶40∶30,V/V/V,磷酸调节pH值至 4.5);柱温:室温;流速:1.0mL·min-1;检测波长:227nm;进样量:20μL。

2.2 标准溶液的制备

2.2.1 药物贮备溶液的制备 分别精密称取紫杉醇、汉防己甲素10.00、5.00mg,分别用甲醇溶解并分别定容至50、100mL容量瓶中,制备成200μg·mL-1的紫杉醇贮备液和50μg·mL-1的汉防己甲素贮备液,4℃贮藏,备用。

2.2.2 内标贮备溶液的制备:精密称取利血平5.00mg,用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,配制成100μg·mL-1的内标贮备液,用时稀释成25μg·mL-1的内标工作液,4℃贮藏,备用。

2.3 样品处理

取血浆样品0.2mL,加内标溶液20µL(25μg·mL-1),涡旋1min,加入3mL乙醚涡旋5min,4000r·min-1离心10min,将上层乙醚液移取至干净的5mL离心管中,置于40℃水浴中用氮气吹干,残渣用100μL的流动相溶解后取20μL进样。结果表明,在“2.1”色谱条件下,紫杉醇、汉防己甲素和利血平分离良好,峰形尖锐,无拖尾现象;血中内源性物质对测定无干扰。大鼠血浆色谱见图1。

图1 大鼠血浆色谱图A.空白血浆;B.紫杉醇、汉防己甲素标准品+内标空白血浆;C.血浆样品;1.紫杉醇;2.汉防己甲素;3.利血平Fig1 HPLC chromatograms of rats plasmaA.blank plasma;B.paclitaxel and tetrandrine standard+blank plasma;C.plasma sample;1.paclitaxel;2.tetrandrine;3.crystoserpine

2.4 标准曲线的制备

取大鼠血0.2mL,分别加紫杉醇、汉防己甲素系列标准溶液20μL,配制成紫杉醇浓度为0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20μg·mL-1和汉防己甲素浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg·mL-1的血浆样品,按“2.3”项下方法操作,取20μL进样分析。以血浆样品中药物峰面积与内标峰面积之比(A)为纵坐标,药物浓度(c)为横坐标,进行线性回归,得紫杉醇回归方程为A=0.281c+0.023(r=0.9990)、汉防己甲素回归方程为A=0.535c+0.009(r=0.9993)。结果表明,紫杉醇血药检测浓度在0.02~20μg·mL-1、汉防己甲素血药检测浓度在0.02~5μg·mL-1范围内同其与内标峰面积比值呈良好线性关系。紫杉醇和汉防己甲素最低检测浓度均为0.01μg·mL-1。

2.5 回收率试验

2.5.1 提取回收率试验 取大鼠空白血浆0.2mL(18份),配制高、中、低浓度(紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1,汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1)的血浆样品各6份,按“2.3”项下方法操作,评价提取回收率。提取回收率试验结果见表1。

2.5.2 方法回收率试验 取“2.5.1”项下的高、中、低浓度血浆质控样品,评价方法回收率。方法回收率试验结果见表1。

由表1可知,高、中、低浓度的样品提取回收率均>70%,高、中、低浓度的方法回收率结果的RSD均<5%,说明该分析方法的回收率满足体内分析的要求。

2.6 精密度试验

取大鼠空白血浆0.2mL,按“2.5”项下方法制备高、中、低浓度(紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1,汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1)的质量控制样品,分别在同一天内测定 5次,计算日内精密度;并连续测定5d,计算日间精密度。精密度试验结果见表2。

表1 回收率试验结果(±s,n=6)Tab1 Results of recovery tes(t±s,n=4)

表1 回收率试验结果(±s,n=6)Tab1 Results of recovery tes(t±s,n=4)

成分 c/μg·mL-1紫杉醇汉防己甲素0.051.0020.000.050.505.00提取回收率/%84.7±2.991.7±1.193.8±1.570.8±2.577.9±1.986.0±2.2方法回收率/%102.7±3.7104.0±3.1100.5±2.2101.0±4.7104.5±2.8104.8±2.4

表2 精密度试验结果(n=5)Tab2 Results of precisions test(n=5)

由表2可知,高、中、低浓度的血浆质控样品的日内和日间RSD均<10%,说明本分析方法的日间、日内精密度满足要求。

2.7 样品稳定性试验

取空白血浆200μL,分别加入不同量的紫杉醇和汉防己甲素,制备高、中、低浓度(紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1,汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1)的溶液,充分混匀,按“2.3”项下方法操作,分别在室温条件放置不同时间(0、4、8h)、冻融条件(反复冻融3次)下进行HPLC测定。结果表明,紫杉醇、汉防己甲素在室温和冻融条件下稳定性良好,浓度未发生明显变化,高、中、低浓度的RSD均<10%。

2.8 动物实验

取Wistar大鼠6只,ig给予自制复方紫杉醇制剂,给药后分别于0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24h,后眼眶静脉丛穿刺取血0.5mL,分离得到的血浆样品经预处理后进行HPLC测定。结果表明,紫杉醇和汉防己甲素的血药浓度值均在标准曲线的定量范围内。血药浓度-时间曲线见图2。

3 讨论

关于紫杉醇的血药浓度测定方法已有很多报道,但同时测定血浆中紫杉醇与汉防己甲素含量的研究却未见报道。由于紫杉醇紫外吸收波长较低,受内源性物质干扰较大,因此有文献报道用固相萃取柱[4]进行提取分离,但成本较高。另有文献报道用叔丁基甲醚[5~8]、乙酸乙酯[9]、二氯甲烷[10]提取紫杉醇,

图2 血药浓度-时间曲线Fig2 Plasma concentration-time profile of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma

但是内源性物质干扰很严重。本研究采用乙醚为提取溶剂,经过液-液萃取,方便、快捷,内源性物质不干扰药物的测定,且提取回收率较高。

本研究所建立的HPLC法简便、快速、分离效果好、成本低、准确度和精密度好、回收率和灵敏度高,可用于紫杉醇、汉防己甲素在大鼠体内的血药浓度测定,为临床合理用药提供理论依据。

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Simultaneous Determination of Paclitaxel and Tetrandrine in Rats Plasma by HPLC

SUN Fang-di,HOU Yue,PAN Hao
(School of Pharmacy,Shenyang Parmaceutical University,Shenyang 110016,China)
SUN Fang-di,GUO Tao
(Dept.of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China)

OBJECTIVE:To establish the RP-HPLC method for the simultaneous determination of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.METHODS:With crystoserpine as the internal standard,the plasma sample 200µL was extracted with ether,evaporated under gentle N2stream and the residual was resolved with mobile phase.The samples were separated on Platisil ODS(250mm×4.6mm,5μm)column with a mobile phase of methol-acetonitrile-0.01mol·L-1dipotassium hydrogen phosphate(30∶40∶30,pH adjusted to 4.5with phosphoric acid)at the flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 227nm.RESULTS:The linear ranges were 0.02~20μg·mL-1(r=0.9990)for paclitaxel and 0.02~5μg·mL-1(r=0.9993)for tetrandrine.The method recovery was 100.5%~104.0%and 101.0%~104.8%and the extraction recovery was 84.7%~93.8%and 70.8%~86.0%,respectively.The RSD of intra-day and inter-day both were less than 10%.CONCLUSION:The method is specific,simple,accurate and reproducible for pharmacokinetics study of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.

RP-HPLC;Paclitaxel;Tetrandrine;Pharmacokinetics

#通讯作者:主任药师,博士研究生导师。研究方向:中西药制剂、临床药学。E-mail:sy-guotao@263.net

R969.1;R971+.1

A

1001-0408(2011)19-1737-03

Δ中国博士后科学基金资助项目(20060390978)

*硕士研究生。研究方向:中药新剂型。电话:024-28851435。E-mail:sunfangdi@sohu.com

2010-06-12

2010-12-09)

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