大叶羊蹄甲中黄酮类化合物提取方法的初步研究

钟 佳，马金晶，罗 雯，宋 爽，叶艳青

(云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650521)

大叶羊蹄甲为豆科(Leguminosae)褐毛羊蹄甲属(Bauhinia)植物的干燥藤茎，秋、冬季采收，除去侧枝，切成厚片，干燥．具有清热凉血、祛风解毒、活血通经、消肿止痛等功效［1］．关于羊蹄甲属植物的研究文献报道不多［2－4］，对于其中的黄酮类化合物的超声提取研究未见报道．本文采用正交试验，分别用醇提法和超声波提取大叶羊蹄甲中的黄酮类化合物，比较2种方法的提取效果及黄酮类化合物的含量，从而得到最佳条件［5－7］．

1 实验部分

1．1 仪器和试剂

WFJ7200型分光光度计(尤尼柯 UNICO);AR224CN型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司);SP－752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);电热恒温干燥箱(天津市津北真空仪器厂);SG3200HE型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)．

大叶羊蹄甲原药(购于西双版纳傣族自治州民族医药研究所原药材);芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);乙醇(分析纯)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠;实验用水为去离子水．

1．2 实验方法

1．2．1 大叶羊蹄甲中黄酮类物质的测定

1)标准曲线的绘制．称取120℃干燥恒重芦丁100.8 mg，用60%微热乙醇溶解，定容至100.00 mL，得质量浓度为1.008 mg/mL的标准储备液．分别准确吸取标准使用液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL于9只25 mL容量瓶中，加10 mL 30%乙醇，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min ，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置10～15 min，于500 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线．标准曲线的回归方程：Y=12.512X+0.015 3，R2=0.999 9．

2)样品中总黄酮的测定方法．准确吸取样品液1．0 mL，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，取2 mL于25 mL容量瓶中，按标准曲线制备方法测定吸光度．所测样品吸光度值经标准曲线回归方程换算后，得出提取液总黄酮浓度，然后按下式计算提取率：

提取率(%)=(C×稀释倍数×V)/W ×100%．

C：根据所测定的溶液的吸光度值，代入回归方程计算出相应的总黄酮含量;

W：实验称取大叶羊蹄甲的质量;

V：测定时大叶羊蹄甲的定容体积．

1．2．2 大叶羊蹄甲预处理

将大叶羊蹄甲用自来水快速冲洗干净后，再用去离子水洗2～3次，置于烘箱中，于60～65℃烘5 h，取出冷却后粉碎，过孔径为0.301 mm的筛，将筛好的粉末置于干燥器中备用．

1．2．3 提取方法

1)醇提法．准确称取2．000 g大叶羊蹄甲粉末，加入一定体积的乙醇，进行醇提回流，抽滤，定容，用分光光度法对其黄酮类物质含量进行测定．取提取温度，提取时间，乙醇体积分数，固液比进行正交试验，醇提法因素及水平设计见表1．

表1 醇提法因素水平设计

2)超声提取法．准确称取2．000 g大叶羊蹄甲粉末，用乙醇浸泡24 h，在室温下进行超声提取，抽滤，定容，用分光光度法对其黄酮类物质含量进行测定．取超声频率，超声时间，乙醇浓度，固液比进行正交试验，超声波提取法因素及水平表设计见表2．

表2 超声波因素水平设计

2 结果与分析

2．1 醇提法提取效果

由表3可知，回流温度的极差最大(1．31)，提取时间的极差最小(0．15)，根据极差分析表明，醇提法的因素影响大小依次为：回流温度＞乙醇体积分数＞固液比＞提取时间．最后确定出最佳提取条件为：回流温度为80℃，乙醇体积分数为80%，固液比1∶20，提取时间为1 h．该条件下黄酮提取率为11．81%．

表3 正交实验结果与分析

2．2 超声提取法提取效果

由表4可知，固液比的极差最大(0．6)，超声频率的极差最小(0．11)，根据极差分析表明，超声波因素影响大小依次为：固液比＞乙醇体积分数＞超声时间＞超声频率．最后确定出最佳提取条件为：超声频率为500 W，超声时间为15 min，乙醇体积分数为90%，料液比为1∶15．该条件下黄酮提取率为14.56%．

表4 正交实验结果与分析

3 结论

1)经过比较可知，在各种不同条件下，超声提取法对大叶羊蹄甲中黄酮类物质的提取率都比醇提法的高，且时间短，主要由于超声的空化作用引起的机械力和热作用．所谓超声空化，就是一种超声在液体内形成空化泡的现象．空化泡在液体中迅速产生、长大、压缩、闭合、崩溃，这个运动过程不断地快速重复，会产生瞬时高温、高压，并有强烈的冲击波和高速射流伴随产生，致使大叶羊蹄甲中的细胞壁破裂，从而加快了溶剂进入细胞内的速度，促进细胞中的总黄酮类物质直接、快速地向溶剂中溶解、转移，并加快了转化速度［8－10］．与醇提法的浸润、渗透、解吸、溶解、扩散、置换等过程相比，超声法的超声空化作用大大加速了总黄酮类物质的提取速度，缩短了提取时间，增加了大叶羊蹄甲中总黄酮类物质提取率．

2)正交试验结果显示：超声时间、超声频率、溶剂的不同浓度等都对超声提取大叶羊蹄甲中总黄酮类物质提取率有一定的影响．其超声波因素影响大小依次为：固液比＞乙醇体积分数＞超声时间＞超声功率．用超声提取法提取大叶羊蹄甲的黄酮类物质，最佳的提取工艺是固液比为1∶15，乙醇浓度为90%，超声时间15 min，超声功率为500 W，在此条件下，得到黄酮的提取率为14．56%．

［1］云南省食品药品监督管理局．云南省中药材标准：傣族药［S］．3版．昆明：云南科技出版社，2007．

［2］张群芳，宋爽，郭俊明，等．微波消解－原子吸收光谱法测定大叶羊蹄甲中的金属元素［J］．云南民族大学学报：自然科学版，2010，19(2)：119 －121．

［3］赵燕燕，崔承彬，孙启时．羊蹄甲属植物研究进展［J］．沈阳药科大学学报，2004，21(6)：476 －480．

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