黄芪注射液对结肠癌SW480细胞的生长抑制作用

樊占兵，李 明，魏双江，秦彩娟，肖庆旺

河北省滦县人民医院普外一科，河北滦县 063700

黄芪注射液是我国开发的一种中药制剂，目前在临床上已得到广泛运用，能提高患者免疫力。有关黄芪注射液抗肿瘤作用的相关研究，国内外报道非常少。本文将黄芪注射液对人结肠癌SW480细胞体外抑制及诱导凋亡的作用实验结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

流式细胞仪(Bechman Coulter公司，EPICS-XL型)；Bio-Tek酶联免疫检测仪 (PE公司，型号ELX-800)；人结肠癌SW480细胞(中国科学院上海细胞生物所)；黄芪注射液(成都地奥九泓制药厂，批号：9709008)；奥沙利铂(L-OHP，江苏恒瑞医药公司)；小牛血清(浙江省杭州四季青生物公司)；四甲基噻唑氮蓝(MTT，Fluka公司)；二甲基亚砜(SIGMA 公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；RPMI1640培养液(美国GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司)；

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW480细胞用加10%小牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测对数生长期SW480细胞 实验分为空白对照组、奥沙利铂对照组（20 μg/ml）和黄芪注射液实验组（125、250、500、1 000 μg/ml），每组设 3 个复孔，以不含细胞的RPMI 1640培养液为空白对照组(调零组)，各组细胞按不同处理后培养48 h，检测时加入20 μl MTT（浓度为5 mg/ml），继续孵育4 h，弃上清后每孔加二亚基甲砜150 μl，振荡溶解，酶联检测仪测定570 nm波长处的吸光度OD值（λ=570nm）。细胞增殖抑制率计算：细胞抑制率(%)=[（对照组OD-实验组OD）/对照组 OD]×100%。

1.2.3 PI细胞染色FCM法检测SW480细胞凋亡 取常规传代的SW480细胞，每组3瓶，用含0.1%小牛血清的RPMI-1640培养基处理24 h进行细胞周期同步化后，分别加入不同浓度的药物。培养48 h对数生长期收集细胞，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，振荡，无菌PBS洗涤，重复3次。振荡后加入-4℃的95%乙醇1 ml固定，上流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

应用SPSS12.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，检验水准取α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察

普通高倍显微镜400倍下观察，加药后SW480细胞数量减少，细胞体积缩小，变圆，折光性差，细胞脱落漂浮，胞浆浓缩，核染色质固缩，细胞核碎裂。

2.2 MTT法检测黄芪注射液对SW480细胞的抑制作用

与空白对照组比较，125 μg/ml以上浓度的黄芪注射液对SW480细胞生长增殖有明显的抑制作用，且与作用浓度呈正比（P=0.000＜0.01）。 结果见表1。

表1 MTT法测定黄芪注射液对SW480细胞的抑制作用（±s，n=3）

表1 MTT法测定黄芪注射液对SW480细胞的抑制作用（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01

组别空白对照组奥沙利铂对照组黄芪注射液实验组125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml 1 000 μg/ml OD 值（λ=570 nm）1.372±0.001 0.897±0.012 1.177±0.213 0.891±0.013 0.690±0.089 0.383±0.141抑制率（%）0 34.6*14.2*35.1*49.7*72.1*

2.3 流式细胞仪FCM法分析结果

空白对照组SW480细胞自然凋亡率为0.86%，奥沙利铂20 μg/ml对照组凋亡率为9.41%，黄芪注射液作用SW480细胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各组的凋亡率分别为24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。细胞周期分析提示，加用黄芪48 h后G1期细胞数量增多，S期细胞数量减少，黄芪注射液使SW480细胞的生长停滞在G1期，并且促进G1期细胞凋亡，并在一定范围内呈浓度依赖性。统计分析表明125 μg/ml以上浓度的黄芪注射液组SW480细胞凋亡率较空白对照有明显升高，有显著性差异（P=0.000＜0.01）（表2）。

表2 FCM法分析黄芪注射液对SW480细胞周期和凋亡率的影响（%）

3 讨论

黄芪注射液是常用的一种补气用药制剂，具有补气升阳、益卫固表等功效。黄芪中含有黄芪多糖、黄芪皂苷、黄酮类、多种氨基酸及铁、锰、锌、硒等多种微量元素。这些成分具有不同的生物学活性，如清除氧自由基，增加巨噬细胞吞噬病毒的抗病毒能力，具有多方面的免疫调节和免疫增强作用，具有双向调节免疫功能，是一种免疫调节剂[1-3]，提高机体抗病能力。目前大多数研究人员认为黄芪抗癌作用并非药物直接杀灭癌细胞，而是通过对机体的免疫调节，诱导淋巴细胞产生IL-2和IFN，直接或间接参与细胞因子和免疫系统的调控，从而达到诱导癌细胞凋亡。据报道[4-9]黄芪注射液可以用于大肠癌患者手术化疗后免疫功能低下的治疗，增强化疗药物疗效，减少细胞毒性药物的损伤，保护骨髓维护造血功能，提高患者生存质量，延长生存期，取得较佳治疗效果。

大肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病率居肺癌、乳腺癌之后而占第三位。近年各地资料显示其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着人们的健康与生命[10]。目前常用的化疗药物存在选择性低，毒性大，价格贵，易产生耐药性等缺陷。因此寻找靶向性强，毒性低，价格优惠，分子量小，易穿透肿瘤组织的新型药物是抗肿瘤新药开发研究的发展方向。大多数化疗药物都通过诱导肿瘤细胞凋亡，因此其可能是不同机制抗癌药物发挥作用的共同通路[11]。刘成军等[12]报道黄芪注射液能抑制人类小涎腺腺样囊性癌细胞株增殖并诱导细胞凋亡。李琼等[13]发现黄芪注射液对人乳腺癌细胞株MDAMB-435的体外增殖具有抑制作用。Tin等[14]研究表明黄芪可以作为结肠癌有效的化疗制剂或配合传统化疗治疗结肠癌，目前机制不明。因此我们尝试应用黄芪注射液行体外实验，探讨其是否诱导人结肠癌SW480细胞凋亡，寻找其作用机制。

本实验以不同浓度的黄芪注射液不同时间直接作用于人结肠癌SW480细胞株，普通光镜下观察细胞形态学变化，结果显示癌细胞数量减少，细胞体积缩小，变圆，折光性差，细胞脱落漂浮，胞浆浓缩，核染色质固缩，细胞核碎裂。通过MTT法检测发现，黄芪注射液对SW480细胞生长增殖有明显的抑制作用，且与作用浓度呈正比。本实验还通过FCM法检测黄芪注射液对SW480细胞生长周期的影响，结果表明对照组SW480细胞自然凋亡率为0.86%，黄芪注射液作用SW480 细胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各组的凋亡率分别为24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。细胞周期分析显示实验组黄芪注射液对人结肠癌SW480细胞的体外增殖具有抑制作用，并能促使SW480细胞阻滞于G1期，诱导SW480细胞凋亡。本研究为黄芪注射液用于临床治疗大肠癌患者提供了有力的依据。

[1]李佳.黄芪穴位注射升白细胞的临床观察[J].现代中西医结合杂志,2007,16(8)：1101-1102.

[2]陈雪华,刘炳亚,袁民,等.黄芪和药饼灸对5-Fu治疗中所致荷结肠癌小鼠免疫功能低下的正向调节作用 [J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18(5)：453-455.

[3]Cho WC,Leung KN.In vitro and in vivo anti-tumor effects of Astragalus membranaceus[J].Cancer Lett,2007,252(1)：43-54.

[4]沈克平,胡兵,张晖,等.黄芪注射液联合IL-2改善大肠癌患者免疫功能研究[J].中药药理与临床,2008,24(2)：99-101.

[5]王志武.注射用黄芪多糖治疗中晚期大肠癌33例[J].实用中医内科杂志,2008,22(5)：73-74.

[6]肖月升,杨震玲,耿建芳,等.黄芪党参蘑菇煎在大肠癌治疗中的辅助作用[J].时珍国医国药,2008,19(7)：1683-1684.

[7]胡广银,江瑾.黄芪桂枝五物汤加减治疗奥沙利铂神经毒性观察[J].现代中西医结合杂志,2010,19(11)：1350-1351.

[8]崔慧娟,李欧静,谭煌英,等.黄芪注射液防治含奥沙利铂化疗方案所致神经毒性效果的临床观察[J].药物不良反应杂志,2009,11(4)：249-251.

[9]黄智芬,刘俊波,黄常江,等.黄芪注射液配合西药治疗肿瘤化疗后血小板减少症30例[J].中国中医药科技,2010,17(1)：21.

[10]Cappell MS.The pathophysiology,clinical presentation,and diagnosis of colon cancer and adenomatous polyps[J].Med Clin North Am,2005,89(1)：41-42.

[11]许杜娟,吴强,杨雁,等.黄芪总苷的抑瘤作用及其作用机制[J].中国药理学通报,2003,19(7)：823.

[12]刘成军,韦世秀,李牡艳,等.黄芪注射液对人类小涎腺腺样囊性癌细胞株的抑制作用[J].中国医院药学杂志,2005,25(5)：406.

[13]李琼,刘胜.黄芪注射液对人类乳腺癌细胞株生长的抑制作用[J].中国药理学通报,2007,23(2)：100-101.

[14]Tin MM,Cho CH,Chan K,et a1.Astragalus saponins induce growth inhibition and apoptosis in human Colon cancer cells and tumor xenograft[J].Carcinogenesis,2007,28(6)：1347-1355.