液相色谱-质谱法检测渔业养殖水中硝基呋喃及氯霉素药物

张立坚,张俊杰,张良滔,蔡 春

(广东医学院分析中心,广东湛江 524023)

液相色谱-质谱法检测渔业养殖水中硝基呋喃及氯霉素药物

张立坚,张俊杰,张良滔,蔡 春

(广东医学院分析中心,广东湛江 524023)

建立了同时测定渔业养殖水中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮及氯霉素等5种抗生素药物的超高压液相色谱-电喷雾电离串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)分析方法。水样用 HLB萃取柱净化、浓缩后,洗脱液经氮气吹干,残渣用V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液溶解,以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相,经ZORBAX SB-C18色谱柱分离后,用串级质谱多反应监测模式做定性定量分析。该方法在0.5μg/L或1～40μg/L浓度范围内具有良好的线性,相关系数均大于0.996,检出限(S/N=3)为0.5～1μg/L,平均回收率为90.3%～104.2%,相对标准偏差为5.4%～10.0%。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS);硝基呋喃;氯霉素;固相萃取;渔业用水

硝基呋喃和氯霉素(chlo ramphenicol,CAP)是两类人工合成的广谱抗生素。硝基呋喃类药物中常见的品种有呋喃唑酮(furazolidone,FZD)、呋喃西林(nitrofarazone,NFZ)、呋喃妥因(nitrofarantoin,NFT)和呋喃它酮(furaltadone FTD)等4种。这两类抗生素常用于动物各种传染性疾病的治疗,对多种病原菌有较强的抑制作用,曾在水产养殖业中得到广泛应用,同时也带来了水产品中的药物残留。硝基呋喃类药物及其代谢物具有潜在的致癌和诱导突变作用;氯霉素能抑制人体骨髓造血功能,引起人类的再生障碍性贫血,粒状白细胞缺乏症,新生儿、早产儿灰色综合症等疾病,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性。因此,我国及世界各国均禁止这两类药物在所有食品动物养殖中使用[1-2]。由于这两类药物具有高效价廉的特点,在我国水产养殖过程中仍然可能存在非法使用和误用的情况。为确保渔业无害养殖,实现从目标监控向过程监管的转变,加强水产养殖过程的应用药物监测和规范管理,控制违禁药物的使用和误用,保证水产品的质量安全,对养殖场的水质进行实时监控就显得非常重要。

硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速,其代谢物以组织结合蛋白的形式持续存在。因此,目前许多报道的方法都主要是针对动物性食品中硝基呋喃类的代谢物进行检测[3-4]。但是,水产养殖业中硝基呋喃类药物的非法使用主要是直接撒入养殖水中,对养殖水中原药的检测可以从源头上监控其非法使用。目前原药的检测方法主要用于饲料及兽药中[5],氯霉素的检测也主要针对海产品等动物源性食品[2,6],并未见渔业养殖水中硝基呋喃类原药和氯霉素同时检测的报道。本研究建立渔业养殖水中硝基呋喃类及氯霉素两类药物5种组分的样品前处理方法和超高压液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测方法(UPLC-ESIM S/M S),希望可有效应用于养殖场水质的监测,保证水产养殖的无害生产。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

1200SL超高压液相色谱仪(配有 G1312B二元泵、G1322A脱气机、G1329B自动进样器),串联6430B三重四极杆质谱仪:美国Agilent公司产品,配有电喷雾电离源及M asshunter工作站;M S2型漩涡振荡器:德国 IKA公司产品;Sigma 3K15台式高速冷冻离心机:德国Sigma公司产品;M illi-Q超纯水器:美国M illipore公司产品;Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL):美国Waters公司产品。

1.2 主要材料与试剂

呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮及氯霉素(标准品,纯度 ≥98.5%):德国 D r.Ehrensorfer公司产品。上述标准品均配成 10 mg/L单个标准储备液,于-18℃以下保存,临用前用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。

乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯):德国 Merck公司产品;实验用水为超纯水;其他试剂为分析纯。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱:Aglient ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm ×50 mm ×1.8μm);流动相:0.1%甲酸-水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脱条件:0 min、30%B,0.5 min、30%B,1 min、65%B,1.5 m in、85%B,2 m in、100%B,2.5 min、100%B,3 min、30%B;流速 0.3 m L/min;进样量5μL;柱温25 ℃。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离方式:呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮为正离子模式,呋喃妥因、氯霉素为负离子模式;离子源温度300℃;脱溶剂气温度350℃;脱溶剂气流速11.0 m L/min;多反应监测模式(M RM);其他参数列于表1。

表1 5种化合物的 UPLC-MS/MS仪器参数Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 5 compounds

1.4 样品前处理

HLB固相萃取柱依次用1 m L甲醇和1 mL水活化,取10 m L水样,以1 mL/min速度过柱,再依次用1 m L 5%甲醇-水溶液淋洗小柱,用2 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱并收集洗脱液,氮气吹干 ,加 200μLV(乙腈) ∶V(水)=1 ∶1混合溶液,漩涡振荡溶解,以15 000 r/min离心5 min,取上清液,待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别取0.1 mg/L呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮及氯霉素单标溶液,不过柱直接进样,在正、负离子模式下做全扫描,选择适当的分子离子峰和电离方式;再对分子离子进行二级质谱分析,得到碎片离子信息,选取丰度最强和次之的离子作为各组分的定量和定性检测离子,并根据质谱图的灵敏度选择电离源的正负检测模式。结果表明:呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮选择正离子模式;呋喃妥因、氯霉素选择负离子模式。然后对各组定性和定量离子的锥孔电压及碰撞气能量等参数进行优化,使分子离子与特征碎片离子强度达到最大。

2.2 色谱条件选择

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下电离,因此流动相的组成和添加剂不但影响目标化合物的保留时间和峰形,还会影响目标化合物的离子化效率,从而影响灵敏度。本研究分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相对灵敏度和分离度的影响,结果表明,采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相有较好的色谱分离和分析灵敏度。5种化合物在多反应监测模式下的特征离子质量色谱图示于图1。

图1 5种化合物在多反应监测模式下的特征离子质量色谱图Fig.1 Ion chromatograms of 5 com pounds under multiple reaction monitoringmode

由标准储备液配制质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 和40.0μg/L 混标溶液 ,按照上述条件进行UPLC-MS/M S分析,5种药物在0.5μg/L或1～40μg/L浓度范围内具有良好的线性关系,线性方程及相关系数列于表2。由表2可见,本方法测定的5种抗生素线性范围宽、灵敏度高。

2.3 线性关系与检出限

在空白水样中添加5种抗生素的标准溶液,分别按信噪比(S/N)大于10和信噪比大于3计算本方法的定量限(LOQ)和检出限(LOD),结果列于表2。

2.4 回收率与精密度

在不含有这5种抗生素的水样中分别加入混合标准溶液,配制成5、10和20μg/L 3种水平的水样,取10 m L按照1.4的方法进行处理,每个添加水平平行重复测定5次。5种抗生素的平均回收率为90.3%～104.2%,相对标准偏差为5.4%～10.0%,结果列于表3。

表2 5种化合物测定的工作曲线、相关系数、定量下限及检出限Table 2 Regression equations,correlation coefficients,quantitation limitsand detection limits of 5 compounds

表3 方法的回收率与精密度(n=5)Table 3 Recoveriesand precisions in sam ples(n=5)

3 结论

本试验建立了超高压液相色谱-串级质谱测定渔业养殖水中硝基呋喃类和氯霉素两类抗生素共5种组分的同时分析方法,在优化的试验条件下,5种抗生素经 HLB柱萃取、ZORBAX SBC18柱分离,运用LC-M S/M S在多反应监测模式下进行定性和定量的分析。该方法具有灵敏度高、准确度和精密度好的特点,适用于渔业养殖水中5种抗生素的测定。

[1]朱 坚:高效液相色谱-质谱法检测肉和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物残留量[J].质谱学报,2003,24(增刊):121-122.

[2]贺利民,曾振灵,刘雅红,等.氯霉素类三甲基硅衍生物的质谱特征及其残留监测[J].质谱学报,2004,25(2):95-96.

[3]彭 涛,邱月明,李淑娟,等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物[J].检验检疫科学,2003(06):23-25,28.

[4]王荣艳,贾 丽,贾东芬,等.UPLC-MS/MS法快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留[J].分析试验室,2010,29(增刊):368-370.

[5]宋 凯,肖桂英,姜 桥,等.高效液相色谱法同步测定饲料及兽药中4种硝基呋喃类药物[J].粮食与饲料工业,2010,275(3):49-51.

[6]毛丽莎,刘红河,刘桂华,等:动物源性食品中氯霉素残留量的检测方法研究[J].现代预防医学2010,37(6):1 123-1 125.

Determination of 4 Nitrofuransand Chloram phen icol in Fisheries Water by Liquid Chromatography Coupled Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Li-jian,ZHANG Jun-jie,ZHANG Liang-tao,CA IChun
(A na lysis Center of Guangdong M edica l College,Zhanjiang 524023,China)

An ultra high-p ressure liquid chromatography coup led electrosp ray ionization triple-quadrup le tandem mass spectrometry(UPLC-ESIMS/M S)was used for the simultaneous determination of furazolidone , nit rofarazo ne , nit rofarantoin , furaltadone and chloramp henicol in fisheries water.The drugs were extracted and cleaned up by Oasis HLB solid phase extraction cartridge.The extract was evapo rated to dryness under nitrogen and reconstituted in solution withV(acetonitrile)∶V(water)=1∶1.The 5 drugs were separated and detected by ZORBAX SB-C18 using 0.1%formic acid(A)and acetonitrile(B)asmobile phase.The target compoundsw ere confirmed and quantified by M S/M S under multiple reactions monitoring(MRM)mode with external standard method.Under the optimal condition,the calibration curves of 5 drugs show good linearity with the correlation coefficients rather than 0.997 in the range of 0.5μg/L or 1—40μg/L,the limits of detection(LODs)range from 0.5—1.0μg/L(S/N=3),the average recoveries of 5 drugs are in the range of 90.3%—104.2%,and the relative standard deviations(RSDs)are 5.4%—10.0%.

liquid chromatography coup led tandem mass spectrometry(LC-M S/M S);nitrofuran;chloramphenicol;solid phase extraction(SPE);fisheries water

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0207-04

2011-04-11;

2011-05-30

广东省科技计划项目(2009B020316005)资助

张立坚(1968～),女(汉族),山西人,副教授,从事药物分析和天然产物研究。E-mail:gdmczlj@sina.com