增殖细胞核抗原在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞中表达

钟海潮，赵士海，饶子亮，孙 侠，钟志勇，王 刚，陈系古

(广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

增殖细胞核抗原在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞中表达

钟海潮，赵士海，饶子亮，孙 侠，钟志勇，王 刚，陈系古

(广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

目的 通过建立低氧性肺动脉高压大鼠模型，探讨增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在大鼠低氧性肺血管平滑肌细胞中的表达。方法 将SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、模型组(n=10)，通过间断常压低氧法建立大鼠低氧性肺动脉高压模型，肺组织切片经HE染色后图像分析技术定量检测大鼠肺小动脉的形态改变;免疫组织化学染色法测定肺血管平滑肌细胞内PCNA蛋白表达，并经图像分析半定量检测其表达强度。结果 4周后，模型组SD大鼠MT%、MA%与对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05);模型组SD大鼠肺血管平滑肌细胞内PCNA核蛋白表达(积分面积、累积光密度)与对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。结论 常压低氧4周可成功建立肺动脉高压大鼠模型，PCNA在肺血管平滑肌细胞中的表达量具有差异性提示其可能在肺动脉高压形成过程中起重要作用。

低氧;增殖细胞核抗原;肺动脉

1 材料与方法

1.1 实验材料

羊抗小鼠免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，批号：200811;细胞凋亡检测试剂盒：厂家：Roche Diagnotics GmbH，批号：14492200;显微成像系统：奥林巴斯，型号：BX41;图像分析软件：MediaCybernetics，版本：Image-Pro Plus 6.0。

1.2 实验动物

SPF级 SD大鼠20只，雄性，体质量160～200 g，由广东省医学实验动物中心提供【SYXK(粤)2003-0002】。饲养条件：采用12 h∶12 h昼夜间断照明，室内保持20～25℃，自由饮食。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.3 实验方法

1.3.1 建立肺动脉高压大鼠模型：SPF级SD大鼠20只，雄性，随机分为正常对照组、模型组，每组10只。将模型组置于常压低氧箱内，箱内浓度稳定于(10±0.5)%，8 h/d，连续4周。每天观察和记录动物外观体征、行为活动和二便情况。

1.3.2 标本采集：两组大鼠经乙醚麻醉后，经股动脉放血法处死。于 4℃，4%多聚甲醛固定 36～48 h，经脱水透明后石蜡包埋切片，片厚 4 μm，行HE染色、免疫组织化学染色检测。

1.3.3 肺组织切片的半定量分析：显微镜下观察大鼠肺组织切片，用Image-pro plus 6.0图像系统进行图像采集并进行图像分析，测量与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外径、管壁厚度、血管总面积及管壁面积，计算管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(MA%)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 实验动物一般情况观察

2组动物活动未见异常，行为活泼，毛发光润、口、眼、耳、鼻均无异常分泌物，二便排泄无异常。将低氧组大鼠放入低氧箱中，大鼠从活跃状态转入睡眠、安静、少动状态。

2.2 低氧大鼠肺动脉血管的病理检测

经过肺小血管图像分析，常压低氧4周后，模型组大鼠的MT%、MA%分别为51.31±18.14和64.5±16.5，均高于对照组(分别为 36.89±12.63和59.6±12.5)，差异有显著性(P＜0.05)，提示低氧4周后低氧性肺血管重建形成。

2.3 PCNA在肺血管平滑机细胞中的表达

免疫组织化学图像分析结果提示，模型组大鼠肺组织切片PCNA表达(积分面积、累积光密度)分别为685.6±2719.47和2950.89±1773.68，均高于对照组(分别为 3422.20±2194.96和 2160.57±1465.92)差异有显著性(P＜0.05)。

3 讨论

低氧性肺血管结构重建是低氧性肺动脉高压的重要病理基础。近年来受到越来越多的重视。本实验通过建立低氧性肺动脉高压大鼠模型，探讨增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在大鼠低氧性肺血管重建中的作用。实验结果表明，模型组 SD大鼠的 MT%、MA%与对照组比较，显著性升高(P＜0.05)，结果提示模型组大鼠的肺血管出现了重塑现象，提示低氧肺血管高压大鼠的造模是成功的。

PCNA首先由Miyachi等在1978年发现。PCNA是一种仅在增殖细胞内合成和表达的酸性多肽，又称周期素(cyclin)，为DNA多聚酶δ的辅助蛋白，是细胞合成期必不可少的因子［3］。PCNA最重要的功能是其在核酸代谢中作为DNA聚合酶6的辅助蛋白，是DNA合成不可缺少的物质，而DNA合成是细胞增殖周期中的关键。PCNA的含量随细胞不同增殖周期而变化，自Gl晚期出现并开始增加，在s期达高峰，在G2期、M期逐渐减少到含量甚微。这表明PCNA的出现与细胞增殖周期密切相关，是反映细胞增殖活性的重要生物学指标［4］。

本研究结果显示，模型组SD大鼠肺血管PCNA核蛋白表达(积分面积、积分光密度)与对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)，结果提示低氧4周后在鼠形成肺血管结构重建，同时肺小动脉PCNA表达增强，提示PCNA在低氧性肺血管结构重建及肺动脉高压形成中起重要作用。

作者认为，PCNA在大鼠低氧性肺动脉高压和肺血管重建过程中起到一定作用，但其在人体是否有相同表现，其作用的信号转导途径、作用发生的阶段、早期干预能否预防肺动脉高压和肺血管重建的发生以及如何延缓其进展尚待进一步研究。

［1］ 冯晓东，蔡英年.内皮衍生因子(ET/NO)与低氧性肺动脉高压.基础医学与临床.1996，16(1)：6.

［2］ 蔡英年.肺动脉高压形成时肺血管细胞的增殖和调节.生理科学进展，1992，23(3)：29.

［3］ Iwase M，Imamura Y，Noriki S，et al.Immunohistochemical detection of early-stage carcinogenesis of oral leukoplakia by increased DNA2 instability and various malignancy markers［J］.Eur J Histochem，2001，45(4)：333-346.

［4］ 麻世红，谭文华.子宫内膜癌中FHIT、PCNA蛋白的表达及意义［J］.哈尔滨医科大学学报.2009，43(1)：65.

Expression of PCNA in pulmonary artery smooth muscle cells of hypoxic pulmonary hypertensive mice

ZHONG Hai-chao，ZHAO Shi-hai，RAO Zi-liang，SUN Xia，ZHONG Zhi-yong，WANG Gang，CHEN Xi-gu
(Guangdong Medical Laboratory Animal Center，Foshan 528248，China)

Objective To establish a mouse model of hypoxic pulmonary hypertension and to explore the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in aorta and pulmonary artery smooth muscle cells of rats with hypoxic pulmonary hypertension.Methods SPF SD mice were randomly divided into 2 groups：normal group(n=10)and hypoxia group(n=10).The mouse model of hypoxic pulmonary hypertension was constructed by intermittent ordinary pressure hypoxia.Histology of HE stained lung tissue sections and image analysis were performed to detect the morphological changes of pulmonary arterioles.PCNA level in pulmonary artery smooth muscle cells were detected by immunohistochemistry，and the PCNA concentration was determined by semi-quantitative image analysis.Results Four weeks later，MT%and MA%in the SD mice of hypoxia group were significantly higher than that of normal group(P＜0.05).PCNA ribonucleoprotein expression(area IOD)of pulmonary artery smooth muscle cells in the SD mice of hypoxia group was significantly higher than that of the normal group(P＜0.05).Conclusions The method of intermittent ordinary pressure hypoxia can be successfully used to construct a hypoxic pulmonary hypertensive mouse model within four weeks，suggesting that PCNA expression may play a very important role in the formation of chronic HPH.

Hypoxia;PCNA;Pulmonary artery;Rat

Q95-33

A

1005-4847(2011)01-0089-02

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.020

低氧性肺血管收缩和重建是低氧性肺动脉高压症的两个主要病理变化，是肺动脉高压持续存在的根本原因［1，2］。增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在细胞增殖的启动上起重要作用，是一种反映细胞增殖活性的重要指标。本研究通过建立大鼠肺动脉高压模型，观察低氧性肺动脉高压大鼠肺血管平滑机细胞PCNA表达水平，旨在探讨PCNA在低氧性肺动脉高压发病中的可能作用，为应用该药防治肺动脉高压提供实验依据。

广东省科技计划项目(2008A060202002)。

钟海潮 (1986-)，男，助理实验师，从事实验动物病理学工作。

王刚(1966-)，男，高级兽医师，从事实验动物和比较医学研究工作，E-mail：gdmlac@gmail.com

2009-11-05