Caspase-3和JNK与脑缺血再灌注后细胞凋亡的关系

张 霞 高维娟 朱炎杰 (承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

缺血性脑血管病是目前神经内科最常见的一种疾病，占全部脑血管疾病的43% ～65%，严重威胁人类生命健康，其致残率非常高。对这种疾病的治疗一般是以疏通堵塞的血管改善病变部位的血液供应为主，而当缺血部位的血液供应好转以后就容易发生更加严重的再灌注损伤，其中细胞凋亡发挥着重要的作用。再灌注损伤的发生机制非常的复杂。现就Caspase-3和JNK与脑缺血再灌注后细胞凋亡关系综述如下。

1 Caspase-3与脑缺血再灌注损伤

1.1 Caspase-3在脑缺血再灌注损伤中的作用 脑缺血/再灌注损伤是一种常见的、复杂的病理生理过程。有研究表明〔1〕，脑缺血后随着再灌注时间的延长，缺血侧皮层凋亡细胞数量明显增加，主要分布在梗死灶边缘区，48 h凋亡细胞达到高峰，说明凋亡在脑缺血/再灌注损伤中起重要作用。凋亡需要细胞内一些基因的调控和能量的消耗，涉及多种蛋白的参与。以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段、细胞缩小、最终形成凋亡小体等形态变化为特征。

目前一些学者认为，脑缺血后神经细胞的凋亡过程主要通过天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(caspase)依赖途径和非caspase依赖途径实现的，而Caspase-3是caspase依赖途径中起关键作用的物质。其中Caspase-3蛋白是缺血后介导神经细胞凋亡的关键蛋白酶〔2〕。Tominaga等〔3〕首次证实缺血性脑损伤可引起神经细胞凋亡，近年来许多学者从形态学、分子生物学等方面研究证实，细胞凋亡参与脑缺血再灌注损伤。Ferrer等〔4〕报道健康成年大鼠大脑中动脉线拴法(MCAO)后，于缺血后再灌注1、4、6、12 h不同时间点，通过免疫组化方法观察缺血脑组织中Caspase-3蛋白的表达情况，发现缺血后再灌注1 h无Caspase-3激活，缺血后再灌注4 h Caspase-3表达增加，缺血后再灌注6、12 h表达继续增加，与细胞凋亡趋势相同，说明了Caspase参与了脑缺血再灌注后损伤。Le等〔5〕发现缺失Caspase-3基因的大鼠缺血2 h再灌注48 h皮层梗死体积减小55%，TUNEL阳性细胞密度减小36%，揭示了Caspase-3与脑缺血后神经元凋亡的关系。赵敏等〔6〕研究中，证实大鼠局灶性脑缺血及再灌注早期Caspase-3表达变化不明显，再灌注6～48 h逐渐增高，在48 h达到高峰，与神经元凋亡DNA裂解率表达时间分布一致。几乎是在相同的时间，同样提示Caspase-3参与了缺血后细胞凋亡过程，并起重要作用。应用Caspase-3抑制剂可使缺血神经元的损伤明显减轻，也支持脑细胞缺血死亡涉及Caspase-3活性的观点〔7〕。另有文献报道，在缺血缺氧性脑损伤及脑缺血再灌注损伤中，应用Caspase-3抑制剂可有效地减少脑缺血后神经元凋亡的数量，从而起到脑保护作用〔8〕。以上研究结果说明Caspase-3参与了缺血性脑损伤，并在缺血神经元的凋亡过程中发挥重要作用。

1.2 Caspase-3在脑缺血再灌注损伤中的作用机制 Caspases是正常细胞程序化死亡和损伤依赖性凋亡的关键介质，在正常细胞作为一种基本成分表达，并与其抑制剂共存，以防意外激活而引起细胞损伤。是目前已知的凋亡最后执行因子，凋亡的最后实施是通过Caspases的激活而实现的。Caspases的激活表现为“瀑布式”的级联反应，Caspase-3在细胞凋亡过程中居中心地位，是细胞凋亡的关键蛋白酶，在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽作用〔9〕。它受多种因素的影响而激活，激活后的Caspase-3可以切割许多蛋白质底物，包括Casepase的特异性底物多ADP核糖聚合酶(PARP)，细胞骨架蛋白(a-spectfin、B-spectrin、actin、tau蛋白等)、参与调节细胞骨架的蛋白gelsolin以及抗凋亡蛋白bcl-2等，使细胞内一些参与DNA修复、mRNA剪切和DNA复制的酶失活或下调，从而使细胞丧失修复功能，稳态不能正常维持〔10〕，不可逆的使细胞核浓缩，DNA断裂，从而导致细胞凋亡〔7〕。

凋亡信号启动后，Caspase-3可经线粒体依赖途径和细胞表面死亡受体(如TNFα-R1、FAS)途径激活，在脑缺血再灌注损伤过程中，由Caspase依赖的线粒体凋亡通路已经得到实验研究的证实〔11，12〕，其中，细胞色素 C(CytC)和 Caspase-3 起着关键的作用。CytC是第一种被发现的线粒体释放的促凋亡蛋白。在线粒体损伤后，CytC作为应激传感器被释放到胞质中，在ATP/dATP存在的情况下能与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和Caspase-9形成凋亡体，进而激活下游的 Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡〔13〕。同时Caspase-3被认为是线粒体细胞凋亡途径的中心环节和执行者〔14〕。

细胞受体途径是另一重要的细胞凋亡途径，其中Fas是此途径主要的信号分子，Fas与脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生密切相关〔15〕，是凋亡发生过程中重要的“死亡分子”〔16〕，一旦细胞表面表达Fas时，可与具有同源性死亡区的fas相关死亡区蛋白结合，后者再通过其死亡效应区与Caspaae-8前体相结合从而激活Caspase-8，启动Caspase级联反应，最终激活Caspase-3，导致细胞凋亡。

2 JNK与脑缺血再灌注后细胞凋亡

2.1 JNK在细胞凋亡过程中的作用 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者，在真核细胞中，已确定出4条MAPK信号转导通路，即细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路、C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路、P38通路及 ERK5通路〔17〕。JNK信号通路是MAPK中重要的通路，也是广泛存在神经细胞中的一条信号转导途径。JNK通路主要在促细胞凋亡中发挥作用。特别是缺氧，缺血再灌注等应激情况，它的激活在细胞凋亡中发挥着重要的作用〔18〕。

最近许多研究报道已经证明神经细胞缺血再灌注导致ERK、JNK、P38激活，ERK的激活保护神经细胞免受缺血再灌注的损伤，而JNK、P38激活导致神经细胞凋亡。Xia等〔19〕研究首次发现JNK在神经元中的致凋亡作用，试验通过去除小鼠PC-12嗜铬细胞瘤中神经生长因子，引起了持续的JNK和p38酶的激活及ERK的抑制，由JNK-p38和ERK的动态平衡决定细胞的存活或死亡。Okuno等〔20〕观察到大脑中动脉线栓法(MCAO)后60min MCA区活化JNK增加，通过TUNEL染色及凋亡相关DNA片段分析，发现JNK选择性抑制剂SP600125抑制了脑缺血诱导的神经细胞凋亡，而且可以阻断细胞凋亡因子Bax从胞浆转入线粒体。说明了JNK的活化可以导致脑缺血后的神经元凋亡。Herdegen〔21〕等结扎大鼠左大脑中动脉90 min致局灶性脑缺血后再灌注，发现梗死灶周围组织可检测到JNK活化的底物磷酸化C-Jun的高表达，于缺血再灌后72 h磷酸化C-Jun表达逐渐下降。同时，缺血侧脑组织海马、皮质JNK活化伴有神经元凋亡。Jiang等〔22〕采用大脑中动脉线栓法(MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用免疫组化法和免疫印迹法检测ERK和JNK的活性，同时观察缺血侧脑组织凋亡细胞数。结果显示缺血再灌注脑组织JNK蛋白的活性升高，凋亡细胞数增多。另有文献表明〔23〕，敲除JNK3基因不仅减少了其下游c-Jun的磷酸化，而且保护了因脑缺血低氧导致的脑损伤;通过JNK3基因缺失小鼠研究证实，JNK3介导中枢神经元的凋亡。JNK3的缺失在人脑肿瘤的发生和发展中扮演了重要角色〔24〕。另外，鼠脑内JNK3编码基因的缺失可抵制外毒素的神经毒性，造成神经元凋亡反应障碍，进而证实了JNK在应激诱导的神经元致死效应中的作用。以上资料表明JNK在脑缺血再灌注后细胞凋亡发挥着重要作用。

2.2 JNK信号通路的激活及其促凋亡的可能机制 JNK信号通路是由应激引起的。研究证明MEKKl-JNKK-JNK通路在细胞凋亡信号转导中起重要的作用。在各种应激下，JNK分别由MAPKK类的JNK激酶1、2(即 MKK4、MKK7)激活，后者由不同的MAPKKK即MEKKI/2/3/4激活。JNK由 JNKl、JNK2和JNK3组成，JNKl，JNK2的表达具有广泛性，JNK3局限于脑、心脏等组织。JNK包含双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr，与c-JunN端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化。JNK的活化是通过其氨基酸残基磷酸化，一旦被激活(称为pJNK)，立即从胞浆中移位到细胞核作用其底物。目前已知JNK蛋白激酶的底物主要有3种转录因子:c-Jun、Elk-1、活化转录因子-2(ATF-2)。活化的C-Jun可以聚合成二聚体而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)复合物，这种复合物通过与其靶DNA结合相结合激活下级基因而发挥其抗凋亡作用〔25〕。而JNK促进细胞凋亡的机制有二〔26〕:一方面，激活的JNK使c-Jun磷酸化，一起转位到核内。核内JNK-c-jun/AP-1促进FasL的表达，导致细胞凋亡;另一方面，部分激活的JNK在胞浆中调节BcI-2家族成员(前凋亡蛋白Bax，Bid)，引起Bax转位于线粒体，促进细胞色素释放，激活caspase-3等，引起细胞凋亡。

实验观察到在脑缺血再灌注损伤中激活的JNK通路可调控凋亡相关基因家族成员的差异性表达:如Bad、Bax的表达上调和Bcl-2、Bcl-xl的表达下调。JNK也可通过激活胞浆中的Caspase家族、诱导Fas配体的表达、磷酸化p53和NF-kB等途径导致细胞凋亡〔27〕。

3 JNK与caspase的相互关系

Guan等〔28〕在局灶性脑缺血再灌注的研究中发现，JNK激酶被激活后可能通过JNK介导的外源性和内源性凋亡通路，而不仅是某个或某些蛋白或激酶的激活发挥作用。Chen等〔29〕在铜诱导神经细胞凋亡研究中认为Caspase-3与JNK的激活有关，研究发现活化的Caspase-3在铜诱导24 h开始升高，48 h达到最高点，迟于磷酸化的JNK，因此可以推测Caspase-3位于JNK的下游。Troy等〔30〕研究中也发现JNK是Caspase-2，-3活化的上游信号蛋白。Carbom等〔31〕在沙土鼠持续缺血模型中检测了JNK信号通路在海马CAl区神经元凋亡中的作用，研究表明脑缺血后海马CA1区Caspase-3与p-c-jun表达呈正相关，并得出推论，局灶性脑缺血后各种刺激因素导致p-c-jun过度激活，再通过一系列的凋亡蛋白激活Caspase级联反应，最终以Caspase-3为凋亡的最终执行者，引起细胞凋亡。同时大量研究认为激活的JNK可以聚集到线粒体外膜上，催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性，从而促进细胞凋亡，最终导致线粒体损伤，活化 caspase-3，启动依赖 caspase通路的凋亡程序〔32〕。Moosavi等〔33〕却发现 Caspase 可激活 MAPKs通路中上游蛋白激酶，这些活化的蛋白激酶可以诱导JNK和/或p38磷酸化，表达P53和Fas配体等转录蛋白，诱导细胞凋亡。Sun等〔34〕认为JNK-MAPK活化后可上调TNF-α的合成，从而启动依赖Caspase的受体凋亡途径 而TNF-α反过来又促进JNKMAPK的进一步活化，从而形成一个恶性循环使其效应进一步放大。所以Caspase与JNK在脑缺血再灌注后细胞凋亡是相互关联，关于其具体机制还不太清楚，所以JNK与Caspase的相互调控关系还有待进一步明确。

4 结语

脑缺血再灌注可诱导细胞凋亡，如何阻止这种迟发性神经元死亡挽救缺血半暗带成为目前治疗的主要方向〔35〕脑缺血再灌注后细胞凋亡机制是一个复杂的多因素过程，对细胞凋亡机制的探讨及减少凋亡的发生有重要的现实意义。目前，尽管对JNK信号通路和Caspase在脑缺血再灌注后细胞凋亡中作用的研究取得了一些进展，但要完全揭示其作用机制，还需深入研究。深入研究JNK信号转导通路与Caspase在细胞凋亡中的关系，有助于进一步阐明细胞凋亡的机制，并可能提供脑血管疾病预防和治疗的新思路。

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