分子标记技术在斑潜蝇中的应用进展

王帅宇, 雷仲仁, 董保信, 任宝珍, 卢增全

(1.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193; 2.山东省植物保护总站,济南 250100)

分子标记技术在斑潜蝇中的应用进展

王帅宇1,2, 雷仲仁1*, 董保信2, 任宝珍2, 卢增全2

(1.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193; 2.山东省植物保护总站,济南 250100)

斑潜蝇是农作物、蔬菜和花卉等植物上的重要害虫,尤其是美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇和三叶斑潜蝇的入侵,给我国农业生产和对外贸易带来重大损失。采用传统的形态学分类特征对斑潜蝇进行鉴定极易混淆,更难进行地理分布与遗传多样性分析,近年来迅速发展的分子标记技术为解决斑潜蝇遗传及鉴定等问题提供了有效的手段。本文主要概述了DNA分子标记技术在斑潜蝇的分子鉴定、地理分布及传播途径、种群遗传分化及种间杂交等方面的应用现状,并对其应用前景进行了展望。

分子标记技术; 斑潜蝇; 分子鉴定; 传播途径; 种群遗传分化

斑潜蝇属于双翅目(Diptera)、潜蝇科(Agromyzidae)、植潜蝇亚科(Phytomynidae)。其中美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)、南美斑潜蝇(L.huidobrensis)、三叶斑潜蝇(L.tri folii)等是世界重要的检疫性害虫,其暴发为害时给农作物、蔬菜和花卉等带来巨大损失,严重时甚至可导致作物绝产[1]。近年来,斑潜蝇仍在不断扩散,目前在南、北美洲、大洋洲、非洲和亚洲等30多个国家均有发生,严重威胁分布地的农作物、蔬菜、花卉等安全生产。

由于斑潜蝇个体较小,并且很多种类形态上极其相似,仅依靠传统的形态学鉴定很难区分。同时,斑潜蝇作为一种入侵害虫,对其传入途径和地理分布与遗传多样性的了解,可为其持续控制提供更多的科学依据,而获得这些信息,传统的形态学与生理生化方法很难实现。分子标记技术具有信息含量高、多态性好、稳定性高、不易受环境变化和发育情况影响等优点,在揭示物种不同水平的遗传变异研究中有其独特的优势。目前多种分子标记技术已广泛用于昆虫学研究[2-5],限制性内切酶片段长度多态性、随机扩增多态性DNA以及核内与线粒体部分基因序列等已逐步应用于斑潜蝇研究[6-10]。本文概述了DNA分子标记技术及其在斑潜蝇中的应用现状,并对其在斑潜蝇的应用前景进行了分析和展望。

1 DNA分子标记概述

DNA分子标记技术发展主要分为3个阶段:第1代分子标记是由Botesin提出的限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)。对于RFLP而言,主要是存在大量不同识别位点的限制性内切酶与基于高变区内的大量探针可供选择。但由于需要使用放射性标记的探针,安全性低而且试验成本增加。改良后的PCRRFLP,虽不需要标记及探针,酶切后产物可直接电泳,但如果片段太小或距离过近,将会影响对试验结果分析。第2代分子标记以PCR技术为核心,包括以随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)、简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat,ISSR)等分子标记。随着技术的不断发展,大大降低了对样品数量和质量要求。方法简单,省时省力,而且稳定性和多态性高,为研究带来很大便利。另外,利用PCR技术对特定DNA区域扩增,如对核糖体DNA和线粒体DNA一些基因片段的研究,因其直观性和真实性也受到研究者的青睐,目前已得到广泛应用。第3代分子标记以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为主,是个体间由完全相同序列界定的单个核苷酸的差异(单碱基转换、颠换、插入和缺失),建立在DNA芯片技术的基础上,与其他分子标记相比,SNP分辨率最高也最为丰富,覆盖基因组范围大,遗传上也较稳定[11-15]。

上述每种分子标记均有各自的优缺点,无法满足理想的遗传标记的所有要求,使用中应根据研究的需要选择相应的标记技术。

2 斑潜蝇的分子鉴定

斑潜蝇属内有多种在形态上极其相似,如南美斑潜蝇、番茄斑潜蝇、美洲斑潜蝇、三叶斑潜蝇等,仅依靠形态学特征很难区分。并且斑潜蝇种内存在高度的遗传分化,甚至存在隐种[9,16],正确鉴定其种类是可持续控制的基础,对于制定科学有效的综合治理策略具有重要的指导意义。

当前在斑潜蝇近缘种鉴定应用较多的为mtDNA基因组中的COⅠ、COⅡ基因序列和rDNA的ITS区域。其中,Ochando等和邱一中等采用RAPD-PCR方法分别得到了南美斑潜蝇的特异条带和鉴定6种斑潜蝇的3条引物[5,7],初步实现了斑潜蝇的分子鉴定,但RAPD存在重复性差等缺点。Masetti等运用RFLP-PCR,以COⅠ序列为靶标,对同时发生在意大利的莴苣类作物上的南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇和番茄斑潜蝇进行了研究,得到了南美斑潜蝇特异性酶切位点,从而可从分子水平快速有效地区分南美斑潜蝇与三叶斑潜蝇和番茄斑潜蝇[6]。管维等通过扩增三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇的ITS序列,进一步筛选得到了可以区分三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇的特异性酶切位点[11]。最近,陈萍等在原来研究的基础上,通过分析斑潜蝇COⅡ基因序列变异,采用3种限制性内切酶,得到了三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、番茄斑潜蝇和葱斑潜蝇的特征酶切位点,建立了PCR-RFLP分子标记对该5种斑潜蝇种类的检测鉴定方法[17-18],此方法比RAPD结果更稳定可靠,但PCR扩增完成后需再进行酶切,降低了检测的时效性。

另外,一些学者通过直接比较不同基因序列差异来获得用于鉴定斑潜蝇的分子标记,Scheffer通过直接比较线粒体DNA中的COⅠ和COⅡ基因序列变化,证明美国南美斑潜蝇有隐种(cryptic species)存在,美国北部的南美斑潜蝇与南部和中部的南美斑潜蝇相比有明显的变异,认为北部的斑潜蝇应为L.langei,它不是南美斑潜蝇的同物异名,而是不同种[16]。冯贤等建立了利用COⅠ序列鉴定三叶斑潜蝇的实时鉴定体系,王莉萍在ITS序列中找到了不同近缘种的特异性识别位点,可以作为美洲斑潜蝇与其他3个近缘种种间鉴别的分子标记[8]。Miura利用多重PCR对番茄上的三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇的COⅠ序列进行了扩增,三叶斑潜蝇可扩增出2条带,而美洲斑潜蝇扩增出3条带片段,而且不同地理区域,性别、发育周期结果一致,实现了简单快速区分两近缘种[19]。利用DNA直接测序,结果更直观,更准确,但成本高、周期长。从上述研究结果可以看出,分子标记技术的发展为斑潜蝇近缘种的分子鉴定提供了丰富的证据。但这些方法各有优缺点,今后还需要在这些结果的基础上,进一步寻找简便、快速、高效、准确的近缘种鉴定分子标记,实现通过常规PCR扩增直接检测条带有无或片段长度大小差异即可区分近缘种。

3 斑潜蝇的地理分布与传播途径分析

了解斑潜蝇的地理分布及其传播途径,对于明确其入侵过程,寻找及引进天敌,阐明斑潜蝇在入侵过程中或入侵后的生物学变化,预测入侵定殖后的生物学特性以及借鉴有效的防治措施等具有重要的意义。

Scheffer利用 COⅠ和 COⅡ基因序列联合分析,认为世界很多区域的南美斑潜蝇都是从美洲的南部和中部传入的[16]。何丽萍运用线粒体DNA中的COⅡ基因序列研究南美斑潜蝇在云南的分布、起源,得出云南的南美斑潜蝇与美洲的不同种群在基因树上聚为一类,亲缘关系最近,也得出了云南的南美斑潜蝇乃是从美洲传入的,这与Scheffer得到的结果一致[16,20]。但利用分子标记技术研究斑潜蝇的地理分布和传播途径分析还未见报道。另外,外来入侵种传播方式复杂,能够成功定殖有可能经历了多次入侵,而且定殖后又可能成为新的入侵源[21],这就需要进一步扩大分子标记技术在斑潜蝇研究中的应用范围,从多方面对不同地区、不同种类斑潜蝇进行更系统、更深入的研究。

4 斑潜蝇种群的遗传分化

斑潜蝇作为外来入侵物种,在入侵过程中,不同种群在食性、生长发育、繁殖、抗药性等方面发生了很大的变化,这可能与种群基因突变、基因流动、遗传漂变、选择压力等有关,对其遗传机制的研究主要借助于分子生物学手段。而分子标记技术的发展,大大促进了斑潜蝇种群遗传结构的研究。

Morgan首先采用RAPD-PCR分别检测了南美斑潜蝇和三叶斑潜蝇在加利福尼亚中部和南部两地理种群间的差异,其中南美斑潜蝇的两个地理种群经RAPD分析有差异,但三叶斑潜蝇不同地理种群间无差异,经过进一步分析得出:南美斑潜蝇种群间变异主要归因于地理分布,而三叶斑潜蝇的种群间变异与寄主偏好性相关[3]。何丽萍等扩增云南南美斑潜蝇的COⅡ基因序列发现,云南不同地理种群无明显差异,同时也比较了其与斯里兰卡、以色列及印度尼西亚3个亚洲国家及厄瓜多尔、危地马拉及美国3个美洲国家不同种群的亲缘关系,分析结果认为云南的南美斑潜蝇不同种群和美洲的不同种群亲缘关系最近,进而推论云南的南美斑潜蝇可能来自美洲[20]。杜予州、王莉萍等对国内美洲斑潜蝇ITS1和β-tubulin序列进行了分析,结果表明:国内不同地理种群及寄主种群均有一定分化,但分化程度较低[22-25]。冯贤比较了分别来自亚洲、欧洲、美洲8个不同国家的三叶斑潜蝇的COⅠ序列差异,认为不同国家和地区的三叶斑潜蝇种群之间目前无明显分化[8]。而Scheffer利用COⅠ基因对三叶斑潜蝇进行了分析,认为三叶斑潜蝇种内已发生了高度分化,专食辣椒的三叶斑潜蝇可能形成了新的寄主宗甚至新种,而且不同种群的COⅠ高度多态性也表明了三叶斑潜蝇在定殖过程中经历了一个或多个瓶颈[9]。从以上结果可知,目前国内报道的南美斑潜蝇、美洲斑潜蝇和三叶斑潜蝇不同种群均无明显分化,而国外已报道三叶斑潜蝇种内不同寄主种群已高度分化形成新的寄主宗,来自亚洲、欧洲、美洲等地区8个国家的三叶斑潜蝇不同地理种群无明显分化,而来自亚洲、美洲等地区7个国家的南美斑潜蝇种群出现一定程度的分化。

5 种间杂交分析

不同种类斑潜蝇在生态适应性方面有明显差异[25],种间杂交有可能结合两种的优势而产生新的适应性更强的种类,给防治带来困难,所以监测其种间杂交情况具有非常重要的意义。不同的分子标记技术可以有效地鉴别物种的种间杂交,但目前在斑潜蝇中的研究还处于起步阶段,仅Sakamaki研究了美洲斑潜蝇和三叶斑潜蝇的杂交行为。结果表明杂交仅发生于美洲斑潜蝇雌虫和三叶斑潜蝇雄虫,后代全为雌虫,利用ITS序列和COⅠ序列分别对三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇杂交后代作了分析,后代同时具有美洲斑潜蝇和三叶斑潜蝇的分子特征,证明后代确实是杂交产生,而不是孤雌生殖的后代[26]。

6 展望

目前国内外关于斑潜蝇DNA分子标记应用的研究主要集中在rDNA的ITS序列和mtDNA的COⅠ和COⅡ基因序列,由于很多种斑潜蝇属于重要的世界检疫性害虫,这就要求对其分子鉴定必须快速、准确、经济、简便。现在虽有一些研究工作得到了可区分近缘种的分子标记,但缺乏普遍公认的可同时鉴别多个近缘种的简便且有效的分子鉴定技术。近年来迅速发展起来的DNA条形码技术被公认为能够准确地进行物种鉴定,而且操作快速简便[27],DNA条形码技术的关键是DNA条形码的确立,可以通过遗传多态性分析和比较基因组学的方法找到合适的DNA序列作为DNA条形码用于斑潜蝇的分子鉴定。另外,对于斑潜蝇种间杂交、种群分化、起源及传播途径等方面的研究,可采用具有试验程序简单、快速、稳定性高、重复性好、多态性丰富、遗传信息量大等优点的SSR标记和ISSR标记等技术,获得有关斑潜蝇入侵的来源、杂交和基因渗透、瓶颈效应以及入侵因素、物种进化和系统发生等等多方面信息[12-13]。在今后的研究中,可针对斑潜蝇研究的不同目标,借鉴其他入侵生物研究中的分子标记技术应用经验,采用高效的DNA分子标记技术对斑潜蝇进行更全面、更深入的研究,从分子水平为斑潜蝇研究提供有益的补充和佐证。

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App lications of molecular markers in Liriomyza

W ang Shuaiyu1,2, Lei Zhongren1, Dong Baoxin2, Ren Baozhen2, Lu Zengquan2
(1.State Key Laboratory for Biology o f Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100193,China;2.The General Station o f Plant Protection in Shandong,Ji’nan250100,China)

The leaf m iners are the main pest of farm and horticultural crops.A fter invading China,Liriomyza sa

tivae,L.huidobrensisandL.trifo liihad caused great losses in agricultural p roduction and export trade.It is very difficult to identify closely-related species and analyze the geographical distribution and genetic diversity o f populations only based on the morphological charac ters.Mo lecu lar m arkers have been imp roved rapidly in recent years,w hich are ef ficient in solving some essential issues in the identification of related species and genetic differentiation inLiriomyza.In this paper,the applications of m olecular m arker techniques in m olecular identification,geographic distribution,sp read pattern,population genetic variation and hybridization ofLiriomyzawere reviewed,and the application prospects are also discussed.

molecular m arker technique;Liriomyza; molecular identification; spread path; population genetic differen tiation

Q 969.464.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.001

2010-03-11

2010-03-30

国家重点基础研究发展计划(“973”)项目(2009CB119000);国家科技支撑计划(2006BAD08A 17,2006BAD08A08);国家大宗蔬菜产业技术体系(gw zj)

*通信作者E-mail:leizhr@sina.com