低剂量伽玛刀照射治疗对功能区癫痫动物行为及其皮层神经元显微结构的影响

董长征,李文玲,赵文清,岳向勇,郭 韬,康进生

(河北省人民医院,石家庄 050051)

迄今为止,低剂量伽玛刀照射治疗功能区癫痫的机制尚未完全阐明[1],近年研究证实,脑神经元凋亡与癫痫发病机制密切相关[2]。猫脑额叶乙状前回是猫的运动功能区中枢。2007年 5月 ～2007年 8月,我们观察了低剂量伽玛刀照射对功能区癫痫猫模型行为及脑额叶功能区皮层神经元显微结构的影响,探讨低剂量伽玛刀照射抗癫痫发作的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康成年猫 80只,均为雄性,体质量2.5～3.5 kg;注射用青霉素,异丙酚(200 mg/支);Signa 1.5 T核磁共振仪,LEKSELL B型伽玛刀,生物信号定量记录分析系统(MS4000U-1型)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将 80只猫随机分成正常对照组(A组)、癫痫模型组(B组)、伽玛刀治疗组(C组)。A组24只不做任何处理;B、C组各28只,均用猫额功能区皮质多次注射青霉素法制作点燃癫痫模型[3],凡显示连续出现 5次Ⅲ级以上惊厥为达到点燃标准。C组造模成功后给予伽玛刀照射治疗。

1.2.2 照射方法 C组动物用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,将其头部安装于Leksell立体定向头架;用MRI行无间隔定位扫描,层厚2 mm;扫描图像经计算机网络传至Gamma Plan系统制定治疗计划,确定照射靶区位于右侧额叶的X-Y-Z坐标。将固定猫脑的Leksell框架按所定坐标安放在伽玛刀定位架上,用 4mm准直器,对靶区脑组织实施照射,边缘剂量为15Gy。

1.2.3 行为学观察方法 采用Smialowki 6级评分法[4]猫行为学变化。于伽玛刀照射后 4、8、12周,A组取6只,B、C组各 10只再次给予脑额叶皮层青霉素注射,观察实验动物的发作级别,以出现Ⅳ ～Ⅵ级发作为重度发作,仅出现Ⅲ级或Ⅲ级以下为轻度发作。

1.2.4 脑额叶功能区皮层神经显微结构观察及神经元数目测定 于伽玛刀照射后 4、8、12周,各组取18只,用3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。开胸后,经左心室至升主动脉插管,用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4)500 ml行灌流固定。开颅取出照射靶区脑组织,置于4%多聚甲醛后固定6 h;入200 g/L蔗糖溶液,4℃过夜;冰冻切片机做皮层垂直断面冰冻切片,片厚 14μm。采用苏木精—伊红染色,光镜下观察各组动物不同时相脑额叶功能区皮层神经显微结构变化,并计数神经元数目。应用Leica Qwin图像分析软件,每张切片取 5个 400倍视野,测定每个视野的神经元个数,然后计算平均细胞数。

1.2.5 统计学方法 采用SAS8.0软件。实验数据采用±s表示,组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组行为学观察结果比较 A组各时点均未出现痫性发作,B组造模成功后 4、8、12周重度发作率分别为90%、80%、80%,而C组重度发作率分别为70%、60%、30%。在12周时,C组与 B组比较, P＜0.05。

2.2 各组脑额叶功能区皮层神经元数目及显微形态结构改变 A组大脑额叶皮层神经元边界清晰,细胞核呈圆形、椭圆形,染色质在核内分布较均匀,核仁清晰。从第 8周开始,B组细胞结构出现明显异常,残存神经元胞核、胞质深染,边缘不清,胞核内染色质凝聚成块状、边集,甚至核固缩;部分细胞胞质溶解,出现空泡状结构,有的整个神经元呈浓缩状态,体积缩小;可见红色神经元、噬神经现象及卫星现象。C组神经元细胞核大而圆且染色浅,神经细胞内空泡减少,胞质增多,未见核固缩及核溶解现象。各组脑额叶功能区皮层神经元数目比较,见表 1。

表1 各组不同时相猫脑额叶功能区皮层神经元数目比较(个,±s)

表1 各组不同时相猫脑额叶功能区皮层神经元数目比较(个,±s)

注:与A组比较,＊P＜0.05;与B组比较,#P＜0.05

组别 n 4周 8周 12周A组 18 275±56 270±37 271±15 B组 18 231±39 196±14＊ 174±57＊C组 18 246±24 251±48 264±76#

3 讨论

既往研究证实,长期反复癫痫发作可导致包括脑神经元凋亡在内的神经元的死亡,人和动物癫痫病灶中也存在神经元数目减少现象[5,6]。目前,关于伽玛刀治疗功能区癫痫的机制尚不十分清楚。推测可能是由于低剂量的伽玛射线导致癫痫神经元持续的、非破坏性的结构性改变,即神经元的可塑性发生变化[7～10],包括:①癫痫神经元突触结构变化;②癫痫神经元的活性降低,如兴奋性氨基酸浓度减少;③癫痫神经元的传导阻滞,如电镜下发现神经元突触缺失;④癫痫神经元的直接破坏(放射性坏死)。

本研究在成功建立青霉素慢性点燃癫痫动物模型的基础上,从结构形态学改变来探讨伽玛刀治疗功能区癫痫的效果及作用机制。结果在照射后 12周时,伽玛刀照射组发作级别较模型组明显减轻,且试验动物无明显肢体活动障碍。这表明低剂量伽玛刀照射可以降低动物的发作级别,对功能区癫痫发作起到抑制作用,而且不产生明显的神经功能缺失。本研究结果显示,通过青霉素慢性点燃癫痫模型后,观察到癫痫模型组猫脑额叶功能区皮层神经元数目明显减少,且有的整个神经元呈浓缩状态,甚至出现核固缩,说明慢性癫痫动物模型的脑功能区皮层神经元数目减少,且出现典型的凋亡神经元的形态特征;而且,神经元随时间延长可见到细胞损伤呈进行性加重。而伽玛刀治疗组,每个时间点神经元结构损伤均减轻,凋亡细胞减少,整个细胞溶解及空化现象减轻,细胞轻度肿胀。这表明癫痫发作时间越久,损伤越重,说明脑功能区皮层结构损伤与长时间抽搐发作引起的缺氧、缺血性变化有一定的关系。低剂量伽玛刀照射能够较好地抑制慢性癫痫模型中脑皮层神经元数目的减少及神经元凋亡,可能与伽玛刀照射后发作停止或减少,从而减少发作带来的脑的缺氧、缺血所致的细胞凋亡有关。这可能是伽玛刀治疗功能区癫痫的另一重要机制,其他的作用机制还有待进一步研究。

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