动物病原高通量检测技术＊

朱丽萍，颜世敢

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南 250353；2.山东省农科院畜牧兽医研究所山东省动物疫病防控与繁育重点实验室，山东济南 250100）

高通量检测技术是在免疫学、微生物学、生物化学、分子生物学等学科最新研究成果的基础上发展起来的，借助自动化操作系统执行检测过程，通过快速、灵敏的检测仪器采集实验数据并用计算机对数据分析处理，实现大量样品快速检测的新技术。高通量检测技术具有高通量、自动化、微量化、快速、灵敏、精确等特点。病原高通量检测技术可分为高通量免疫学检测技术（检测抗原）和高通量分子生物学检测技术（检测核酸）两大类。前者有液相芯片、抗体芯片、流式细胞术等；后者有基因芯片、变性高效液相色谱技术等。

我国养殖业的集约化程度越来越高，养殖规模越来越大，随之而来的流行病学调查、临床检测、检验检疫的样品数量逐年增加，传统的检测方法和技术已经难以适应当前的生产需要，迫切要求动物病原检测实现高通量化。本文对近年来报道的高通量检测新技术从原理、特点及其在动物病原检测中的应用进展进行了综述。

1 高通量免疫学检测技术

近年来报道的用于检测动物病原检测的高通量免疫学检测技术有液相芯片技术、抗体芯片技术、流式细胞术多色荧光检测等。

1.1 液相芯片

液相芯片（lquid chip）是美国Luminex公司开发的一种基于xMAP技术的新型生物芯片技术。它将芯片技术和流式细胞仪结合为一体，在直径5.5 μm的聚苯乙烯微球标记上编码多达100多种的荧光染料后成为编码荧光微球，以此为反应载体，以流式细胞仪作为检测平台，在液相中完成对各种抗原的高通量检测，因此液相芯片又称悬浮芯片（suspension array）。液相芯片具有快速、灵敏（0.01 pg）、重复性好、检测范围宽（0.2pg／mL～32 000 pg／mL）、微量（10μL）、高通量、检测成本低、操作简单的优点。

液相芯片可用于多种动物病原感染的检测。朱海红等［1］采用液相芯片技术建立了56种常见细菌、病毒高通量检测平台。詹爱军等［2－3］建立的新城疫病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒、水疱性口炎病毒液相芯片检测技术，检测灵敏度达到50TCID50～100TCID50。夏骏等［4］利用液相芯片技术检测H5N1亚型禽流感病毒的灵敏度达10pg。王静等［5］检测鼠疫菌的液相芯片在浓度为0.154ng／mL～4 514ng／mL的范围内具有良好的动力学响应，液相芯片的灵敏度比ELISA法高2个数量级。

1.2 抗体芯片

抗体芯片（antibody chip）是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，在玻片或其他固相支持物表面高密度排列抗体点阵，可特异地捕获样品中的抗原分子，CCD （charge－coupled device）照相技术与激光扫描系统获取阵列图象，用专门的计算机软件进行图象分析、结果定量和解释。抗体芯片具有特异、灵敏、重复性好、高通量的特点，一次可同时检测数千种目标蛋白，灵敏度达到ng／L。

Miller J L等［6］在玻片上先分别包被多聚L－赖氨酸和聚丙烯酰胺凝胶，再固定上184种不同的抗体制成免疫芯片，鉴别出5种差异蛋白。Nettikadan S R等［7］研制的抗体芯片Viri Chip能在30min内检出样品中滴度为108蚀斑形成单位（pfu／mL）的犬细小病毒，而且病毒滴度在108pfu／mL～1010pfu／mL范围内与抗体的结合在4h内都会呈线性而不会达到饱和。Boyler M D等［8］、Saouda M 等［9］采用抗体芯片快速鉴定了化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的外毒素SpeB。Thulasiraman V等［10］运用抗体芯片技术比较了鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）在26℃（跳骚媒介）、37℃（哺乳动物宿主）两种生理状态下蛋白表达模式，找到两种表达水平与温度、Ca2＋相关的毒力因子。Delehanty J B等［11］采用抗体芯片技术对霍乱毒素、葡萄球菌内毒素B的检测灵敏度分别为8μg／L和4 μg／L，检测过程仅需15min。随着单克隆抗体技术、噬菌体展示技术、蛋白质芯片技术的发展、成熟和完善，免疫芯片技术必将广泛应用于临床检测。

1.3 流式细胞术多色荧光检测

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生物学参数同时进行定量检测，并对特定细胞群体进行分选的分析测量技术，具有快速、灵敏、准确及客观、直接和同时进行多参数检测的优点。流式细胞术早期主要应用于医学领域中的肿瘤学和血液学研究，近年来拓展到细菌、真菌和病毒的快速检测及微生物群落结构的研究。细菌、真菌的检测多采用直接检测法，而病毒主要根据细胞表面抗原表达与否来间接判断病毒是否存在，但随着新染料的开发和分子生物学方法的引入及FCM检测精度的提高，利用FCM直接检测病毒已成为可能。

Stopa P J等［12］建立FCM检测炭疽芽胞杆菌的芽胞的方法，有效地降低生物武器对人类的威胁。高明燕等［13］报道利用流式细胞术在H4亚型流感病毒接种36h后检测到病毒感染阳性细胞，不加胰酶也可引起病毒感染，但加胰酶组感染率明显高于不加胰酶组。Barardi C R M等［14］应用FITC标记的抗体识别轮状病毒感染的细胞，运用FCM技术检测感染细胞的数量和感染水平。Marie D等［15］使用新型核酸染料SYBR Green直接检测水环境中的病毒数目取得成功。Defoort J D等［16］在多重PCR的基础上采用FCM 和微球杂交法快速、特异地从同一个血清样品中同时检测到至少3种病原体。Yan X等［17］把 MBDI（Microsphere－based duplexed immunoassay）与FCM结合成功检测到了A、B 2种类型的流感病毒。MClelland RD和Dinder AC用FCM结合单克隆抗体检测食品中的沙门菌，灵敏度达到1cfu／g［18］。在四通路的流式细胞仪上已实现多达13色免疫荧光检测，即同时鉴别检测12种细胞表面标记物，可用于传染病的早期诊断及监测。流式细胞仪还可用于细菌药敏试验，通过测量加入药物孵育后的散射光的DNA含量来判断抗菌药物对细菌的敏感性，这是流式细胞仪在该领域应用的经典方法。

2 高通量分子生物学检测方法

高通量分子生物学检测方法是在PCR或RTPCR基础上发展起来的高通量核酸检测方法，如基因芯片、变性高效液相色谱技术等，可用于动物病原的检测、基因分型及野毒与疫苗毒的鉴别。

2.1 基因芯片

基因芯片（gene chip）又称DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸阵列，是把大量已知核酸序列探针集成在同一个基片（如玻片、膜、硅片、塑料片等）上，经过标记的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交，通过检测杂交信号，对海量的基因信息进行筛选与检测分析。基因芯片技术流程包括芯片的设计与制备、靶基因的标记、芯片杂交与杂交信号检测。基因芯片的制备有原位合成法和点样法两种方法，原位合成法制造的基因芯片密度高、重复性好、质量容易控制，但成本高于点样法，点样法主要用于部分没有商业化的物种的基因芯片的制备。基因芯片具有高度并行性、多样性、微型化和自动化的特点。

1994年第一张商业化基因芯片由Affymetrix公司推出。随后，基因芯片迅猛发展，广泛应用于基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多生命科学领域。在病原检测方面，基因芯片已做到对病原微生物的鉴定、检测及分型、毒力因子测定、耐药性检测，检测的敏感度与PCR相当。宋亚军等［19］、翟俊辉等［20］利用16S、23SrRNA 寡核苷酸芯片对常见病原细菌检测。秦智锋等［21］制备了临床症状相似的4种水疱性动物疾病病毒检测和鉴别基因芯片，实现了大批量货物的集成化检测和快速通关的要求。杨素等［22］制备了可同时检测水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒等7种病原的基因芯片。朱来华等［23］制备了同时检测和鉴别马疱疹病毒Ⅰ型、马动脉炎病毒、马流感病毒、马传染性贫血病毒和东部马脑脊髓炎病毒等5种病毒的基因芯片。曹三杰等［24］制备了同时检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和鸡传染性法氏囊病病毒的基因芯片，其检测灵敏性、特异性与RT－PCR方法基本一致。Sengupta S等［25］利用476个流感病毒特异的21bp的寡核苷酸片段制备了基因芯片，可以区分病毒类型（A、B和C型）、病毒的宿主种类（人、猪、禽、马等）、HA亚型和NA亚型。Bruant G等［26］设计了检测大肠埃希菌189个毒力基因和30个耐药性基因的寡核苷酸基因芯片，可用于大肠埃希菌致病型及耐药性的检测和监测。

基因芯片技术目前尚存在一些缺陷，如检测成本高、芯片制作工艺复杂、信号检测需专门的仪器设备、合成效率及芯片的集成程度低、样品制备的标准化不统一等。

2.2 变性高效液相色谱技术

变性高效液相色谱技术（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是利用通用PCR引物从多种细菌的16SrRNA中扩增含有高度变异序列的片段，将这些来自不同种细菌的扩增产物与参照菌株的扩增产物混和后进行DHPLC检测，产生一个独特的色谱峰图，可作为鉴定细菌种类的分子指纹［27－28］。DHPLC是一种新的基因高通量分析技术，具有高通量、自动化分析、准确、灵敏、重复性好、检测速度快、检测成本低、操作简便安全等优点。DHPLC是不依赖培养的混合微生物样本分析平台，尤其适用于分析无法培养的微生物及混合微生物样本的检测，能鉴定常见菌、罕见菌、厌氧菌及混合微生物样品的分离鉴定，可用于微生物基因分型和鉴定、定性和定量检测混合菌群中各成分的动态变化、基因突变检测、微生物耐药基因突变检测。美国环球基因有限公司根据DHPLC研制了WAVE系列核苷酸片段分析系统。

Hurtle W等［28］利用DHPLC技术检测细菌的特异性为100%，敏感性为91.7%。陈茹等［29］建立了多重PCR－DHPLC快速鉴别检测结核分支杆菌、牛分支杆菌、禽分支杆菌及副结核分支杆菌等4种重要致病性分支杆菌，从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分支杆菌阳性，检测灵敏度为10－2～10－3基因拷贝，检出率高于细菌分离培养法。文献报道了用DHPLC技术同时快速、高通量、检测了动物源性饲料中的沙门菌和志贺菌［30－31］、肉制品中的沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和溶血性链球菌［32］。

3 展望

随着免疫学、微生物学、生物化学、分子生物学等学科的迅猛发展、渗透和交叉，新仪器、新设备、新技术、新方法不断出现及应用，高通量检测新方法、新技术不断涌现。本文只对文献报道的用于动物病原高通量检测的基因芯片技术、抗体芯片技术、液相芯片技术、流式细胞术多色荧光分析技术、变性高效液相色谱技术等部分新技术进行综述，还有一些新技术没有列举。本文介绍的高通量检测新技术是按照抗原和核酸两大类分别进行介绍的，其中有些技术并不局限于单方面的检测，如流式细胞术既可用于抗原检测也可用于核酸检测，而且有些高通量检测技术也不局限于病原检测领域，还可用于新药筛选、抗药性基因筛选等领域。

本文列举的某些新技术已经实现了商品化，如DPHC、FCM等。有些新技术还存在这样那样的不足之处，技术层面还需要完善，有些技术带来的检测费用昂贵，限制了实际应用，如基因芯片、抗体芯片等。相信随着新技术的日臻完善，检测成本的日渐降低，动物病原检测必将发生质的飞跃，促进禽流感、口蹄疫、猪链球菌病、疯牛病、沙门菌病等严重危害养殖业及威胁人类健康和生命安全的人兽共患病及时、快速确诊，在此基础上迅速、有的放矢地采取有效的防控措施。

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