响应曲面法优化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能工艺

涂勇刚，聂旭亮，徐明生，孙春妹，杜华英，赵 燕，董 攀

(1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学理学院，江西 南昌 3 30045；3.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

响应曲面法优化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能工艺

涂勇刚1，聂旭亮2，徐明生1，孙春妹1，杜华英1，赵 燕3，董 攀3

(1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学理学院，江西 南昌 3 30045；3.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

优化木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白起泡性能的工艺。在单因素试验基础上，确定自变量酶解时间、木瓜蛋白酶添加量、酶解温度、pH值的试验水平，以起泡性和泡沫稳定性为响应值，采用Box-Behnken试验设计方法，研究各自变量及其交互作用对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响。然后利用Design Expert软件进行响应面分析，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定蛋清蛋白酶改性的最佳条件组合。结果表明：蛋清蛋白泡沫稳定性酶解模型不显著，而起泡性酶解模型显著，在最佳工艺参数酶解时间45min、酶添加量38.2mg/5mL蛋清、酶解温度47.5℃、pH6.3的条件下，蛋白起泡性可达2.09，此条件下可使蛋清蛋白起泡性提高140%左右。

蛋清蛋白；木瓜蛋白酶；起泡性；泡沫稳定性；响应曲面法

蛋清中的蛋白质含量为11%～13%[1]，是蛋清的主要组成成分。一直以来，蛋清蛋白因其极高的营养价值和其他食品原料所不可比拟的高起泡性能被广泛地应用于蛋糕、面包、冰淇淋粉、冷饮、饼干、饮料等食品的加工中[2-4]。影响蛋清蛋白起泡性能的因素包括温度、pH值、储藏时间、打蛋时间、金属离子和添加剂等，蛋鸡的年龄和产蛋季节也对蛋清蛋白的起泡性有一定的影响[1,5]。为稳定和提高蛋清蛋白的起泡性能，人们尝试用物理法(如：热处理[5-6]、超高压[4-5])、化学法[7]和酶法[3,5]对蛋清蛋白进行改性，使其获得较好的起泡特性。

蛋白质分子经酶水解后可在其表面形成较大的疏水区域，易于吸附在气泡膜表面，有利于增加泡沫的稳定性。有报道[8]称对大豆蛋白进行适度的酶水解可以提高其起泡能力，Were等[9]采用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白，在中性条件下，改性后的大豆分离蛋白的起泡性相当于鸡蛋蛋白的起泡性。李鹏等[10]用纤维素酶酶解花生蛋白以提高其起泡性。目前，酶水解改性提高蛋白质起泡性的研究在植物蛋白领域较多，对蛋清蛋白研究较少。本实验在前期研究的基础上，采用木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白以改善其起泡性能，对木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白的工艺中的几种影响因素进行研究，并采用响应曲面法确定木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白的最佳工艺参数，为高起泡性蛋清蛋白粉的生产提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋 市购。

木瓜蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T25-25G型分散机 上海昂尼仪器仪表有限公司；SL2002N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；HH-6型水浴锅 常州国华电器有限公司；BS224S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHB-1笔型pH计 上海宇隆仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清蛋白的制备

选取新鲜鸡蛋，除去蛋壳和蛋黄，将蛋清放入500mL烧杯中搅拌均匀，备用。

1.3.2 蛋清蛋白起泡性及泡沫稳定性的测定

[11-13]进行，略有修改。具体方法如下：起泡性的测定：在一定温度条件下，用0.2mol/L、pH7磷酸缓冲溶液配制体积分数5%蛋白液100mL于250mL的烧杯中，然后用分散机在9500r/min条件下搅打3min，然后立即记录烧杯中泡沫的高度并转换成泡沫的体积(V0)；泡沫稳定性测定：将上述泡沫体系在室温条件下放置30min，读出液体的体积(V1)。

1.3.3 单因素试验

在250mL烧杯加入一定量的木瓜蛋白酶，再加入95mL pH7.0的缓冲溶液，使其溶解后加入5mL蛋清蛋白搅拌均匀，调节一定pH值后将烧杯放入一定温度的水浴锅中酶解一定时间后分别测定其起泡性和泡沫稳定性。以起泡性和泡沫稳定性为指标，选择酶解时间、木瓜蛋白酶的添加量、酶解温度、p H值进行单因素试验。

1.3.4 响应曲面优化试验设计

在单因素试验的基础上，采用响应曲面法B o x-Behnken设计优化试验，确定3个水平编码表。结果采用Design-Expert 6.0.5进行试验统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解时间对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

由图1可知，木瓜蛋白酶酶解时间对蛋清蛋白起泡性的影响呈现先增加后减小的趋势，在30min时起泡性达到最高点；在180min内酶解时间对蛋白泡沫稳定性影响不大(P＞0.05)，180min以后随着时间的延长蛋清蛋白泡沫稳定性先增大后减小，在240min时泡沫稳定性最好(P＜0.05)。总体而言，与酶解初期相比，蛋清蛋白的起泡能力增加较明显，泡沫稳定性变化不大。这可能是由于水解后蛋白质的平均分子质量降低、表面疏水性和分子的柔性增加，使得酶法改性后的蛋清蛋白分子更容易吸附在气-液界面，并能容易改变构型重排形成有序的蛋白质分子层，所以起泡性增加[14]。综合考虑，酶解时间选择蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性均较好的30min。

图1 酶解时间对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.1 Effect of hydrolysis duration on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.2 木瓜蛋白酶添加量对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

由图2可知，随着酶添加量的增大，蛋清蛋白的起泡性呈逐渐增大的趋势，木瓜蛋白酶的添加量为30mg时，蛋清蛋白的起泡性达到最大(P＜0.05)，30mg以后起泡性相差不大(P＞0.05)。酶添加量对蛋清蛋白的泡沫稳定性的影响随着酶添加量的增大而先增大后减小，在1.5mg时达到最大(P＜0.05)，2.5mg以后就基本保持不变(P＞0.05)。因为形成稳定泡沫的条件是蛋白质分子在气-液界面凝结而形成坚固的薄膜，蛋清蛋白质分子部分酶解后，各肽链展开，有助于它们之间的相互作用而凝结，使起泡力提高。如果水解程度过高，多肽链长度变短，而较短的多肽链不利于气-液界面坚固薄膜的形成，结果使蛋白质溶液的起泡力和泡沫稳定性都会随酶用量的增加而降低[15]。综合考虑，木瓜蛋白酶的添加量为30mg时蛋清蛋白的起泡性和泡沫稳定性较好。

图2 木瓜蛋白酶的添加量对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.2 Effect of papain quantity on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.3 酶解温度对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

由图3可知，蛋清蛋白的起泡性随着温度的升高呈现下降-上升-下降的趋势，稳定性呈现先下降再上升的趋势。这可能是由于达到了酶解反应的适宜温度范围，酶解速度加快，起泡力增大。但当温度超过酶解适宜范围时，会导致蛋白酶丧失或部分丧失催化活性，温度过高也会使蛋清蛋白质产生变性使得蛋清粉起泡力降低[16]。综合考虑蛋清蛋白的起泡性和泡沫稳定性，酶解温度在50℃时较好。

图3 酶解温度对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.1.4 pH值对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

由图4可知，随着pH值升高，蛋清蛋白的起泡性先基本保持不变，当pH＞9后再呈现下降趋势；蛋清蛋白泡沫的稳定性基本不随pH值变化而变化。木瓜蛋白酶的最适pH值为5～6.5，但pH值在3～9范围内皆可进行酶解反应，从图4也可以看出在这段范围附近起泡性和泡沫稳定性变化不大，且均较好。

图4 pH值对蛋清蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on foaming ability and foaming stability of albumen protein

2.2 响应曲面法优化结果

2.2.1 回归方程的建立与显著性分析

表1 木瓜蛋白酶酶解蛋清蛋白响应曲面法试验因素及水平编码表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results for response surface analysis

在单因素试验基础上，确定了酶解时间、酶添加量(100mL 5%蛋清蛋白添加酶的质量)、酶解温度、pH值4个因素的试验水平，水平编码见表1，并在此基础上采用统计软件Design-Expert 6.0.5进行Box-Behnken试验设计，见表2。

对表2试验数据进行回归分析，得起泡性的编码值的二次多元回归方程(模型)为：Y＝2.03-0.027X1＋0.029X2-0.024X3-0.0075X4＋0.0071X12-0.045X22-0.083X32-0.045X42＋0.072X1X2＋0.010X1X3-0.030X1X4＋0.060X2X3-0.085X2X4-0.017X3X4。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析(起泡性)Table 3 Variance analysis of the created regression response surface model for foaming ability

对泡沫稳定性的数据进行回归分析后，发现该模型不显著，因而不进行方差分析。

从表3可以看出，模型P＝0.0006＜0.01，表明模型极显著。失拟项P＝0.6276＞0.05，模型失拟项不显著。模型的调整系数R2＝0.8674，调整绝对系数R2Adj＝0.7348，说明该模型拟合程度良好，可以用此模型对蛋清蛋白的酶法改性进行分析和预测。由表3可知，X1、X2、X22、X42、X2X3对蛋清蛋白的起泡性影响显著(P＜0.05)，X32、X1X2、X2X4影响极显著(P＜0.01)，X3、X4、X12、X1X3、X1X4、X3X4对其影响不显著，采用逐步回归分析的方法，在剔除了不显著项后得到优化回归方程为：Y＝2.03-0.027X1＋0.029X2-0.024X3-0.0075X4-0.047X22-0.084X32-0.047X42＋0.072X1X2＋0.06X2X3-0.085X2X4。

此时模型P＜0.0001，表明模型极显著。失拟项P＝0.6632＞0.05，模型失拟项不显著。说明该方程具有意义，能反映酶解时间、酶添加量、酶解温度、pH值对蛋清蛋白起泡性的影响。

2.2.2 两因素显著交互作用对蛋清蛋白起泡性的影响

图5 各两因素交互作用的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plot of every two factor interactions

2.2.2.1 酶解时间和木瓜蛋白酶添加量的交互作用

由图5a可知，酶解时间和木瓜蛋白酶添加量的交互作用对蛋清蛋白起泡性具有显著的影响，酶添加量在20～30mg范围内，随着酶解时间的延长，蛋清蛋白起泡性逐渐降低，而酶添加量在30～40mg范围内，随着酶解时间的延长，蛋清蛋白起泡性呈现逐渐增加的趋势。

2.2.2.2 木瓜蛋白酶添加量和酶解温度的交互作用

由图5b可知，木瓜蛋白酶添加量和酶解温度的交互作用对蛋清蛋白起泡性具有显著影响，当酶解温度在40～50℃范围内时，酶添加量20～30mg内，随着酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐渐增大，而在酶添加量30～40mg内，随着酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐渐降低。当酶解温度在50～60℃范围内时，随着酶添加量的增大，蛋清蛋白起泡性逐渐增大。

2.2.2.3 木瓜蛋白酶添加量和pH值的交互作用

由图5c可知，木瓜蛋白酶添加量和pH值的交互作用对蛋清蛋白起泡性具有显著影响，在酶添加量20～30mg范围内，随着pH值的增大，蛋清蛋白起泡性逐渐增大，而在酶添加量30～40mg范围内，随着pH值的增大，蛋清蛋白起泡性先增大后降低。

2.2.3 最优条件的确定及验证实验

利用得到的回归方程，分别对X1、X2、X3、X4求偏阶导数，并令其偏导等于零，通过Design-Expert 6.0.5软件计算可知，蛋清蛋白起泡性最优酶解工艺参数为：酶解时间45min、酶添加量38.18mg、酶解温度47.46℃、pH6.28，起泡性预测值为2.06。最优工艺参数修正为：酶解时间45min、酶添加量38.2mg、酶解温度47.5℃、pH6.3，在此条件下进行验证实验，所得蛋清蛋白起泡性实际值为2.09，说明建立的数学模型可靠性高，可以作为蛋清蛋白起泡性的最佳条件。在温度47.5℃、pH6.3、处理时间45min情况下进行同种鸡蛋蛋清未经酶解处理起泡性对比实验，其结果为1.21，因此，与此条件下蛋清蛋白起泡性相比，添加木瓜蛋白酶酶解后蛋清蛋白起泡性可提高70%左右。与未经任何处理的蛋清蛋白起泡性相比，本实验所得木瓜蛋白酶最优条件下酶解后蛋清蛋白起泡性可提高140%左右。

3 结 论

在单因素试验基础上，选择酶解时间、酶添加量、酶解温度、pH值为自变量，以起泡性能和泡沫稳定性为响应值，采用响应曲面法建立各因素与蛋清蛋白起泡性与泡沫稳定性之间的定量数学模型，确定蛋清蛋白起泡性的酶解优化工艺参数为：酶解时间45min、酶添加量38.2mg、酶解温度47.5℃、pH6.3，在此条件下蛋清蛋白起泡性为2.09，可使蛋清蛋白起泡性得到140%左右的提高。

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Response Surface Methodology for Technological Optimization of Papain Hydrolysis of Albumen Protein for Improved Foaming Properties

TU Yong-gang1，NIE Xu-liang2，XU Ming-sheng1，SUN Chun-mei1，DU Hua-ying1，ZHAO Yan3，DONG Pan3
(1. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；3. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The purpose of this study is to optimize the improvement of foaming properties of albumen protein by papain hydrolysis. Foaming capacity and foam stability were investigated with respect to 4 variables including hydrolysis time, papain dosage, temperature and pH. Two quadratic polynomial regression models describing foaming capacity and foam stability were established based on a Box-Behnken experimental design. According to response surface analysis, the foam stability model was not statistically significant, the foaming capacity model displayed a statistical significance, and the optimum enzymatic modification conditions were hydrolysis time of 45 min, enzyme dosage of 38.2 mg/5 mL of egg white, hydrolysis temperature of 47.5℃, and pH 6.3. Under the optimum conditions, the foaming capacity was up to 2.09, indicating an increase of approximately 140% when compared to non-modified albumen protein.

albumen protein；papain；foaming ability；foam stability；response surface methodology

TS253

：A

1002-6630(2011)20-0084-05

2011-06-20

江西省教育厅青年科学基金项目(GJJ11088)；江西农业大学自然科学青年基金项目(9003315)；

江西省科技厅科技支撑计划项目(20112BBF60016)

涂勇刚(1979—)，男，讲师，博士，研究方向为动物性食品科学与技术。E-mail：tygzy1212@yahoo.com.cn