胡柚上柑橘衰退病毒的分子检测

武晓云，刘 琦，郭玉双，武小霞

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300；2.黑龙江省农业科学院园艺分院，哈尔滨 150086；3.贵州省烟草科学研究所，贵阳 550081；4.东北农业大学农学院，大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

胡柚（Citrus changshanensis）原产于浙江省常山县，是一种重要的地方特色柑橘良种[1]。胡柚果实色泽艳丽、果型美观、耐储藏，并且富含多种维生素和人体必需氨基酸和丰富的柑橘类黄酮物质，如柚皮苷（Naringenin）和新桔皮苷（Neohesperidin）等，因此是一种非常值得推广和扶持的柑橘品种[2]。目前，胡柚已成为我国主要栽培柑橘品种之一：全国的种植面积多达一百多万亩，栽培种植的省份包括浙江省、江西省、福建省和湖南省、年均产量100多万t，年产值近20亿元。

胡柚黄斑病是胡柚常见病害之一，染病植株叶片较正常植株明显减少，并且叶片出现黄化症状，植株不能结果或减少，并且果实出现变小、酸味增加。该病害最早报道于上世纪90年代，由于当时条件所限该病害被认为由真菌或细菌引起[3-4]。近年来，该病害的发生范围不断扩大，有暴发流行之趋势，该病害已严重影响胡柚的产量和品质，可能对胡柚整个产业的进一步发展造成严重影响。但是，该病害的病原至今未能得到系统的鉴定，因此严重影响相应防治措施的制定。本文通过血清学和分子生物学检测，从症状表现叶片黄化的胡柚植株中检出柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV），并对胡柚上克隆CTV病毒外壳蛋白（CP）基因的序列与GenBank中登陆的相应序列进行了分析，结果表明胡柚黄斑病可能由CTV一个新的分离物引起。

1 材料与方法

1.1 样品采集

胡柚叶片采集自浙江省常山县，症状表现为叶片黄化，具体采集信息见表1。

表1 胡柚样品采集地点、采集时间及症状Table 1 List of sampling locations and time,and symptoms of Huyou

1.2 血清学检测

采用Agdia公司的CTV ELISA Reagent Set试剂盒进行DAS-ELISA检测，并参照Agdia公司提供的试剂盒说明书进行。DAS-ELISA的阳性对照购自Agdia公司，阴性对照采用健康胡柚叶片（由常山县农业局植保植检站提供）。

1.3RT-PCR扩增和克隆

用TRIzol Reagent（Invitrogen公司）提取胡柚叶片的总RNA。根据文献[5]报道，设计CTV外壳蛋白（CP）基因的通用引物 CP1（5′ATGGACGACGAAA CAAAGA 3′）和 CP3（5′TCAACGTGTGTTGAATTTCC 3′）。用M-MLV试剂盒（Promega公司）根据试剂盒提供的试验步骤配制反转录反应混合液，以CP3为引物合成cDNA第一链。以CP1和CP3为引物进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖进行电泳检测。扩增片段用DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）进行回收后，连接至pGEM-T载体（Promega公司）中，并进行测序测定。

1.4 序列分析

序列拼接和同源性分析采用DNAman 6.02（Lynnon Biosoft）程序进行；应用Clustal X 1.83程序进行多序列比对[6]，用MEGA4.0程序中的最大简约法（Maximum parsimony，MP）构建系统进化树，进化树的可信度用bootstrap进行检测（1 000次重复）[7]。系统进化树中其他CTV分离物及GenBank登录号如下：B165（Accession EU076703）、Mexico（DQ272579）、NUagA（AB046398）、NZ-B18（FJ525436）、NZRB-G90（FJ525432）、NZRB-M12（FJ525431）、NZRB-M17（FJ525435）、NZRB-TH28（FJ525433）、NZRB-TH30（FJ525434）、Qaha（AY340974）、SY568（AF001623）、T30（AF260651）、T36（U16304）、T318A（DQ151548）、T385（Y18420）、HA16-5（GQ454870）、P09.18（GQ424346）和 VT（U56902）。

2 结果与分析

2.1 田间症状观察

对浙江省主要胡柚种植区衢州市和常山县5处胡柚种植株园的胡柚的田间调查表明，胡柚黄化病的发病率在2.3%左右。症状主要包括植株叶片减少、脉间黄化（见图1），结果数量及质量降低，大部分发病植株的茎部不出现茎点的症状，少数植株具轻微的茎点症状。由于发病植株分布具有分散性和不连续性，且路边植株的发病率较中间高，具有病毒病害的特征。

图1 胡柚黄化症状Fig.1 Yelllowing symptoms of Huyou

2.2DAS-ELISA检测

用DAS-ELISA对采集的18个植株表现黄化症状的胡柚进行了检测，结果表明除CS-3、CS-6和QZ-7外，其余15个样品与CTV抗血清均有反应。其中，CS-7与CTV抗体的反应最强（OD值为3.783），约为阳性对照的3倍，其余样品与CTV抗体的反应较弱（见表2）。表明，胡柚黄化病可能与CTV病毒有关。为进一步明确感染胡柚的CTV株系，我们对CS-7样品进行了进一步的分析。

2.3RT-PCR扩增

用CP3进行反转录后，用CP1和CP3进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增的目的条带约700 bp，与预期条带大小一致（见图2）。PCR产物经纯化、克隆、测序分析发现，扩增至目的片段长672 bp（GenBank登陆号：HQ634290）。Blastn同源性搜索结果表明该片段与CTV P09.18分离物（GQ424346）的CP基因具最高相似性，为97.17%[8]。

表2 胡柚样品的DAS-ELISA检测Table 2 DAS-ELISA detection results of different Huyou samples

图2 CS-7样品的RT-PCR检测Fig.2 RT-PCR detection of CS-7

2.4 同源性分析

将克隆的CS-7 CP基因与CTV GenBank中的其他CTV分离物的相应序列用Clustal X 1.83程序进行多序列比对后进行同源性分析。结果表明，在核苷酸水平上，CS-7与P09.18相似性最高（97.0%），其次分别是 NZRB-TH30（96.8%）、NZRB-M17（96.6%）、NZRB-M12（96.5%）、NZRBTH28（96.5%）；在氨基酸水平上，CS-7与P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH28的相似性都为96.6%（见表3）。表明CS-7与P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH28具有较近的遗传关系。

表3 CS-7 major CP的核苷酸及氨基酸序列与CTV不同分离物之间相似性比较Table 3 Similarity between nucleotide and amino acid sequences of major CP of CS-7 and other CTV isolates

2.5 系统进化分析

将克隆的CTV CS-7分离物的CP基因与GenBank中的其他CTV分离物的相应序列用MEGA 4.0程序构建系统进化树（见图3）。在系统进化树中，CS-7与P09.18聚于一小分支后再与NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH30 4个分离物形成一个单独的分支，进一步表明 CS-7 与 P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28具有较近的进化关系。

图3 CS-7与其他CTV分离物构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of CS-7 and other CTV isolates

3 讨论

CTV属于长线型病毒科（Closteroviridae）长线型病毒属（Closterovirus），是世界范围内危害最强、经济意义最为重要的柑橘病害之一[9]。该病毒在我国也普遍发生，全国几乎所有的柑橘种植区都有该病毒发生与为害的报道[10-14]。CTV的寄主范围仅限于芸香科植物，研究表明CTV可侵染绝大多数栽培的柑橘品种。但是，胡柚上至今还未见有CTV分布与为害的报道。本研究首次从血清学和分子水平证实了CTV病毒在胡柚上的存在，表明胡柚也是CTV的寄主之一。

根据对寄主植物造成的症状，CTV可粗分为4个株系：茎陷点株系（Stem-pitting，SP）、衰退株系（Decline inducing，DI）、苗黄化株系（Seedling yellows，SY）和弱症状株系[9，15]。其中 SP 株系以分离物VT为代表，DI株系以T30为代表，SY株系以T36为代表。王洪祥等对浙江省黄岩的“本地早”（Citrus succosa）密柑上的CTV进行了研究[16]，结果表明CTV在“本地早”发生相当普遍，株茎陷点株系、衰退株系和苗黄化株系都有存在，并且发现苗黄株系或强茎陷点株系和碎叶病毒存在复合感染，这是造成黄岩本地早和新本1号产量低下的一个重要原因。在系统进化树中本文分离的CTV株系（CS-7）与上述株系都有较远的遗传距离，而与P09.18、NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH30聚于一分支，表明CS-7可能是CTV一个新的可诱导胡柚植株黄化症状的株系。CTV P09.18分离自美国的California，而NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28来自于新西兰。由于柑橘起源于我国及东南亚等地区，因此P09.18和NZRB-TH30等美国和新西兰的CTV可能通过柑橘及其种苗等的贸易被传入。

在血清学检测中，不同的分离物与抗血清有着不同的反应，表明侵染胡柚的CTV可能也由不同的株系存在，并且可能存在复合侵染现象。因此，有必要扩大样品采集范围，对胡柚上CTV的株系组成以及为害进行更系统的研究，为胡柚黄斑病的防治提供理论基础。虽然，我们从植株表现黄化的胡柚中检测到了CTV病毒，但是胡柚植株黄化症状是否由CTV引起，还有待将该分离物接种至健康胡柚幼苗并完成柯赫氏法则鉴定，但是这最少需要1～2年的时间才可能有结果。

*武小霞为本文的同等贡献者。

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