中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李 健，王晓梅

(1.宝鸡市人民医院 肿瘤科，陕西 宝鸡 721000；2.宝鸡文理学院 化学化工系,陕西 宝鸡 721013)

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，久病可引起多系统的损害，随着人们生活方式的改变，糖尿病的发病率日趋增高，在治疗中，降低餐后血糖以减少并发证的发生是一个重要的方面。中药治疗糖尿病虽然降糖强度较西药弱，但疗效稳定，作用温和，不良反应少，能有效防治并发证。近年来，从中药及其提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究引起了很多学者的关注并取得了一些进展[1-3]。川芎嗪，化学名为四甲基吡嗪，是从川芎的生物碱中分离得到的有效单体，具有活血化瘀、抗血小板凝集、扩张血管等多种作用，因其治疗心脑血管疾病疗效好、不良反应少而广泛用于临床[4-5]。天麻素是天麻的主要活性成分之一,化学名为对羟甲基苯-β-D-呋喃葡萄糖苷。天麻素具有镇静、安眠和镇痛等作用，并有舒张外周血管、增加心脑血管流量、降低脑血管阻力等作用[6-7]。然而，有关二者对α-葡萄糖苷酶的作用尚未见报道。本课题组就川芎嗪和天麻素对α-葡萄糖苷酶活性的影响进行了实验观察，以期对糖尿病药物的筛选提供实验依据。

1 实验材料

注射用磷酸川芎嗪，山东圣鲁制药有限公司，批号：20059313；天麻素注射液，上海现代哈森(商丘)药业有限公司，批号：20066464；α-葡萄糖苷酶，美国Sigma公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,纯度99%)，美国Merck公司；二甲基亚砜，莱阳化工实验厂；所用化学试剂均为市售分析纯，去离子水自制。

DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司;752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BS-244-SS电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 天麻素和川芎嗪对α-葡萄糖苷酶活性的影响 参照文献方法[8]测定天麻素和川芎嗪对α-葡萄糖苷酶活性的影响。酶活力单位的定义:37 ℃、pH 6.8条件下，每分钟水解pNPG释放1 μmol对硝基酚(pNP)所需的酶量，规定为一个酶活力单位(U)。

取10 mL试管若干，依次加入pH 6.8磷酸盐缓冲溶液1.85 mL、0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，不同浓度样品溶液(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/mL)50 μL，0.011 6 mol/L pNPG 50 μL，将上述反应体系在37 ℃恒温水浴保温30 min后，立即加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液8 mL终止反应，以磷酸盐缓冲液为参比，在400 nm波长处测吸光度A。样品终浓度分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5及20 μg/mL，每个浓度同时作3个平行,取平均值。同时测样品及底物的本底吸光度并于计算时扣除。按照公式计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A样品为加入样品后酶促反应的吸光度值，A空白为无样品时酶与底物反应后的吸光度值，且均为扣除本底吸光度的值。

2.2 抑制物的抑制动力学研究 分别取不同浓度(0、5、15 μg/mL)的样品溶液，再分别加入不同浓度的底物(浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L)，测定反应速度，用Lineweave-Burk作图法确定抑制类型。

3 结果

3.1 天麻素、川芎嗪对α-葡萄糖苷酶活性的影响 见图1。由图1可知,在一定浓度范围内，天麻素和川芎嗪溶液对α-葡萄糖苷酶活性均有抑制作用，且抑制作用随提取物浓度的增大而增大，川芎嗪溶液在20 μg/mL时抑制率达84.0%，IC50值为3 μg/mL。天麻素浓度为2.5 μg/mL时，抑制率为55.9%，天麻素浓度为15 μg/mL时，抑制率达89.1%，之后抑制率无明显增大。IC50值为2.4 μg/mL。

图1 天麻素、川芎嗪对α-葡萄糖苷酶活性的影响

图2 川芎嗪对α-葡萄糖苷酶抑制机制的判断

图3 天麻素对α-葡萄糖苷酶抑制机制的判断

3.2 川芎嗪对α-葡萄糖苷酶抑制机制的判断 见图2。由图2可知,通过在含不同浓度样品川芎嗪的测活体系中，改变底物浓度，测定酶促反应的初速度，Lineweaver-Burk双倒数作图，得到一组相交于纵轴一点的直线，斜率随样品浓度的变化而改变，最大反应速度(Vm)不因样品浓度的不同而改变，米氏常数(Km)随着样品浓度的增大而减小，其抑制机制符合竞争性抑制类型的特征。

3.3 川芎嗪对α-葡萄糖苷酶抑制机制的判断 见图3。由图3可知,通过在含不同浓度天麻素的测活体系中，改变底物浓度，测定酶促反应的初速度，Lineweaver-Burk双倒数作图，得到一组相交于左上象限一点的直线，斜率随样品浓度的变化而改变，最大反应速度(Vm)因样品浓度的不同而改变，米氏常数(Km)随着样品浓度的增大而减小，其抑制机制既不符合竞争性抑制类型，也不符合非竞争性抑制的特征，当属于混合型抑制类型。

4 讨论

α-葡萄糖苷酶是位于小肠绒毛膜上的消化酶，其将饮食中的淀粉和蔗糖分解为单糖而被吸收。α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制位于小肠的α-葡萄糖苷酶的活性，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，延缓或抑制葡萄糖的吸收，有效地降低餐后高血糖。本实验的原理是糖苷酶可以与底物PNPG特异性结合，水解PNPG中的α-1，4糖苷键并产生PNP，PNP在400 nm波长处有最大吸收峰。

川芎嗪在结构上有多个甲基，且甲基上的氢具有活性，容易与蛋白质的疏水部位结合，在酶促反应体系中，川芎嗪的甲基可能是通过与α-葡萄糖苷酶活性中心的“疏水口袋”结合而减少了底物与酶的结合进而对底物产生竞争性抑制作用。天麻素结构与PNPG结构相似，二者均有苯基和葡萄糖结构，在酶促反应中，天麻素可以与PNPG竞争性结合酶活性中心的必需基团，从而减少了PNP的产生,同时天麻素含有多个羟基，并有甲基，这些基团可能与酶蛋白活性中心以外的基团结合，从而引起变构效应，也阻碍了α-葡萄糖苷酶水解PNPG的进程，由此产生了对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

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