HPLC-ELSD法测定黄芪汤颗粒剂中黄芪甲苷的含量

王 爽,张钰泉，张 幸，李风华

(上海中医药大学 科学技术实验中心,上海 201203)

黄芪汤颗粒剂由黄芪、生甘草等中药组成，具有补气生津的功效，能不同程度的干预大鼠胆汁瘀积性肝硬化形成[1]。黄芪是黄芪汤颗粒剂的君药，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Beg.var.mongholicus(Beg.)Hisao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Beg.var.mongholicus(Beg.)的干燥根。药理研究表明黄芪具有心肌保护[2]、降血糖[3]、抗肝纤维化[4]等作用。黄芪甲苷(astragaloside IV)是黄芪中的主要化学有效成分，因此，选择测定黄芪甲苷(astragaloside IV)的含量来评价黄芪汤颗粒剂的质量。目前，黄芪甲苷的含量测定方法主要有荧光分光光度法[5]、薄层扫描法[6-7]、柱前衍生高效液相色谱法[8]、HPLC-MS/MS法[9-10]等。因为荧光法要求样品纯度高，薄层扫描法重现性差，高效液相色谱法在紫外区仅有末端吸收且干扰较多，衍生化高效液相色谱法处理样品过程复杂，质谱法专一性较强，但成本过高。本实验采用HPLC-ELSD法，灵敏度高，重现性好，用于没有紫外吸收的黄芪甲苷的含量测定，结果满意。

1 仪器与试样

Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent公司)，Varian 380-LC型蒸发光散射检测器(美国Varian公司)，Agilent 1100化学工作站。

黄芪甲苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号:110781-200613)，甲醇(色谱纯，Merck公司，批号I568307048),正丁醇(分析醇，国药集团化学试剂有限公司，批号T20100305),氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20090902)，水为重蒸水(自制)，黄芪汤颗粒剂(自制)。

2 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil-Keystone ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相:甲醇-水(65∶35)；流速：1.0 mL/min；柱温：50 ℃；进样量：20 μL；氮气输出压力为0.5 MPa；ELSD参数：Evap 90 ℃,Neb 50 ℃,Gas 1.6 mL/min。

3 溶液的制备

3.1 标准溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品13 mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。

3.2 供试品溶液的制备 精密称取黄芪汤颗粒剂2.5 g,加甲醇20 mL，超声提取30 min，抽滤，滤液水浴挥干，加水20 mL,用水饱和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇层，用氨试液洗2次，每次40 mL，合并正丁醇层，水浴挥干，加甲醇定容于5 mL量瓶中，置4 ℃冰箱，备用。

4 方法学验证

4.1 线性关系考察 将黄芪甲苷标准溶液依次稀释成浓度为1 000、800、400、200、100 μg/mL的溶液。分别各进样20 μL，测定黄芪甲苷峰面积色谱图(见图1)。以峰面积A的常用对数值为纵坐标，以各进样浓度C的常用对数值为横坐标进行线性回归。回归方程为：LogA=1.428 8 LogC+0.219 6，r=0.999 8(n=5)。黄芪甲苷在2～20 μg范围内线性关系良好。

4.2 精密度试验 取浓度为800 μg/mL的黄芪甲苷标准品溶液，重复进样6次，测定相应的峰面积，计算黄芪甲苷峰面积的RSD为0.82%。

图1 对照品溶液的HPLC色谱图

图2 供试品溶液的HPLC色谱图

4.3 稳定性试验 取同一分供试品溶液,分别在0、1、2、3、4、5 h进样测定相应的峰面积，计算黄芪甲苷峰面积的RSD为2.05%。

4.4 重现性试验 精密称取5分黄芪汤颗粒剂0.5 g，处理方法同3.2，分别进样测定各分供试品溶液中黄芪甲苷的峰面积，计算RSD为4.12%。

4.5 回收率试验 精密称取已测知含量的黄芪汤颗粒剂共6分，各精密加入黄芪甲苷对照品适量。按3.2方法处理，进样测定各分样品中黄芪甲苷的含量，计算回收率，结果测得平均回收率为101.65%，RSD为2.32%，见表1。

表1 样品中黄芪甲苷的回收率试验结果

5 样品含量测定

精密称取2个批号的供试品,按3.2方法处理，分别取20 μL注入液相色谱仪中，测定黄芪甲苷的峰面积，将峰面积取常用对数后代入线性方程进行计算,求出供试品的含量。2个批号的样品含量测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果

6 讨论

本文用3种方法处理样品，第1种方法直接用水超声处理30 min，用正丁醇萃取4次，每次40 mL,合并正丁醇层，用氨试液洗2次，每次40 mL，合并正丁醇层，挥干，用甲醇定容于5 mL量瓶中。第2种方法先加甲醇超声处理30 min，水浴挥干，加适量水，再按第1种方法操作。第3种方法是在第2种方法的基础上，用D101大孔树脂处理。实验发现,第1种方法不能将中药复方中黄芪甲苷提取完全，第2种方法可将中药复方颗粒剂中的黄芪甲苷提取充分，第3种方法经D101大孔树脂处理后,样品中杂质干扰少一些，但黄芪甲苷损失较多。第2种方法虽然有杂质干扰，但样品处理过程较简单，不影响黄芪甲苷含量测定的准确性。因此，样品处理时采用第2种方法。在稳定性试验中发现,样品放置室温时间过长时黄芪甲苷色谱峰面积有少量升高现象,所以应在样品处理后尽早测定。本实验建立的HPLC-ELSD方法准确、可靠,能满足样品中黄芪甲苷含量测定的要求。

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