p47phox向胞膜移位调节高糖导致的内皮细胞内活性氧升高

王 蕾 吴和平 舒筱灿 舒 旭 伍世挥 罗 海

心血管病事件快速发展是糖尿病患者死亡的常见原因。糖尿病引起心血管病发生的危险性增高的原因很多，其中高血糖诱导的氧化应激对内皮细胞损伤在此过程中起重要作用。氧化应激是指体内活性氧(ROS)生成速率大于清除速率而在体内蓄积的状态。机体产生ROS有多种途径;其中NADPH氧化酶(NOX)被认为是血管内皮细胞ROS产生的主要来源之一[1，2]。NADPH氧化酶是由多个亚基构成的酶复合体，包括胞膜组分gp91phox和p22phox和胞质组分p47phox、p67phox及 Rac;其中 p22phox是该氧化酶的酶促核心[3，4]。本实验用高浓度葡萄糖处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，探讨p47phox对ROS产生的调节机制。

材料与方法

1.主要试剂与仪器:M199培养基、Ⅱ型胶原酶、DPI、apocynin、胎牛血清、DCFH-DA荧光探针、p47phox抗体、流式细胞仪、荧光显微镜。

2.HUVECs的分离培养:①取无菌新鲜脐带，用0.9%盐水冲洗脐静脉;②0.1%的Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉15min;③离心灌注液收集内皮细胞，将其转移到培养瓶中，加入培养基放置培养箱中培养;④待第二、三代细胞长至80%融合状态时用于实验。

3.流式细胞仪检测细胞内ROS水平:①用无血清的培养基冲洗细胞2次;②用1∶500稀释DCFH-DA荧光探针在培养箱中孵育30min，PBS洗涤3次;③胰酶消化，血清终止反应，无血清培养基洗涤2次;④重悬细胞，尼龙网过滤，⑤上流式细胞仪检测细胞内ROS。

4.western blotting检测NOX4蛋白的表达:①去培养基，用4℃的PBS洗涤细胞2次;②加0℃裂解液200μl，冰上孵育20min，③收集细胞裂片及裂解缓冲液，4℃12000g离心10min收集上清，测定蛋白浓度;④取200μg总蛋白与上样缓冲液混匀总体积约30μl，沸水中加热5min;⑤上样电泳，待溴酚蓝到达凝胶底部时，停止电泳;⑥蛋白质电转移1h;⑦蛋白质杂交;⑧ECL化学发光法压片显影，定影。

5.免疫荧光检测p47phox在细胞内的定位:①用PBS洗涤细胞1次，95%乙醇固定15min，PBS洗3次每次5min;②3%牛血清清蛋白封闭15min;③稀释适量比例的一抗孵育1h(阴性对照用PBS代替一抗)，PBS洗3次每次5min;④1∶50稀释的FITC标记的羊抗兔IgG孵育30min，PBS洗3次每次5min;⑤Hoechst33342常温下孵育5min染核，PBS洗2次每次3min;⑥甘油封片，荧光显微镜下观察。

6.实验分组:①正对照组:给予正常培养基培养;②高糖处理组:给予20mmol/L高浓度葡萄糖处理24h;③DPI处理组:5μmol/L DPI预处理0.5h后，给予20mmol/L葡萄糖处理24h;④apocynin处理组:100μmol/L apocynin预处理0.5h后再给予20mM葡萄糖处理24h。

7.统计学处理:所有数据采用平均数±标准差表示，采用单因素方差分析检验，以P＜0.05判定差异的显著性。

结 果

1.细胞内ROS检测:结果如图1所示，正常对照组细胞内ROS水平为1±0.05，高糖处理组为对照组的1.41(1.41±0.07)倍，二者相比差异具有显著性(P＜0.05，n=3)。说明高浓度葡萄糖能够刺激HUVECs内活性氧升高。DPI处理组和apocynin处理组细胞内ROS水平分别为0.49±0.07和1.01±0.05，与高糖组相比，差异均具有显著性(P＜0.05，n=3)。说明DPI和apocynin能够抑制高浓度葡萄糖刺激的活性氧升高。

图1 流式细胞术检测HUVECs内ROS的产生

2.p47phox蛋白表达:对照组细胞内p47phox蛋白与内对照β-actin的相对比值为0.82±0.05，高糖处理组为0.85±0.08，DPI处理组为0.81±0.02，apocynin处理组为0.88±0.01。各组之间差异均没有显著性(n=3，P＞0.05)，说明HUVECs内p47phox的蛋白表达不受高浓度葡萄糖、DPI和apocynin的影响(图2)。

图2 western blot检测HUVECs内p47phox蛋白表达

3.p47phox在细胞内定位:结果显示(图3)，各组免疫荧光强度无明显差异;对照组、DPI处理组和apocynin处理组，p47phox主要在胞质均匀分布，高糖处理组在胞膜周围有高表达现象。说明高浓度葡萄糖能够刺激p47phox向胞膜移位，而DPI和apocynin能够抑制p47phox向胞膜移位。

图3 间接免疫荧光检测p47phox在HUVECs内定位

讨 论

糖尿病是最早被公认的动脉粥样硬化的重要危险因素之一，糖尿病并发心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病引起心血管病发生的危险性增高的原因有很多，包括高血压、异常脂血症、肾病、胰岛素抵抗、高血糖等;其中高血糖导致内皮细胞氧化损伤在糖尿病并发动脉粥样硬化过程中起重要作用。NADPH氧化酶被认为是血管内皮细胞ROS产生的主要来源之一。

大量研究表明，NOX的抑制剂DPI则能够抑制高浓度葡萄糖刺激状态下 HUVECs内ROS的升高[3，5]。Silver在肥胖患者手术中取到的内皮细胞中发现p47phox的表达上调[6];Xia L等人发现，在高糖刺激下，肾小球系膜细胞内的p47phox急剧升高并伴有大量ROS的产生[7]。为了探讨高浓度葡萄糖刺激内皮细胞内ROS产生的机制，我们用高浓度葡萄糖处理HUVECs，并给予DPI和apocynin预处理。细胞内ROS结果显示，正常对照组持续产生低水平的活性氧，因为ROS是细胞内重要的第二信使，调节细胞的生长及分化。高浓度葡萄糖能够刺激HUVECs内ROS的产生，而DPI及apocynin处理组ROS的产生并不增加，提示NOX是高糖所致ROS产生的主要来源之一。其中，有趣的是DPI干扰组ROS水平低于正常，可能有以下几个原因:①DPI抑制NADPH氧化酶的能力强于apocynin;②DPI可能同时影响NADPH氧化酶体其他亚单位的变化。p47phox蛋白表达结果显示，各组p47phox的表达水平都无明显变化，说明p47phox对于ROS的调节作用可能不是通过表达的变化来实现的。

Li等[8]用血管紧张素Ⅱ刺激人血管内皮细胞时观察到细胞内ROS水平显著升高;分别提取细胞中不同亚成分，检测到胞膜中的磷酸化p47phox增高;免疫细胞化学染色及共聚焦显微镜也观察到p47phox在血管紧张素Ⅱ刺激后从胞质向胞膜移位现象。我们推测在HUVECs中，高浓度葡萄糖刺激可能通过调节p47phox移位从而促进NOX源性ROS的产生，因此我们用免疫荧光检测p47phox的细胞内定位。结果发现正常对照组的细胞中，p47phox主要在胞质表达，DPI及apocynin预处理组则与正常对照组相似，而葡萄糖处理组在胞膜周围有高亮度荧光表达，提示p47phox移向胞膜周围。同时4组免疫荧光强度没有明显差异，再一次证明各组p47phox的蛋白表达水平无明显改变。

我们的实验结果证明，高浓度葡萄糖能够刺激HUVECs内NOX源性的ROS升高及p47phox向胞膜移位，DPI及 apocynin能够抑制 ROS的升高和p47phox向胞膜移位，而各组p47phox的蛋白表达无明显变化。提示47phox可能通过从胞质向胞膜移位来调节高浓度葡萄糖刺激状态下内皮细胞ROS产生。

1 Ago T，Kitazono T，Ooboshi H，et al.NOX4 as the major catalytic component of an endothelial NAD(P)H oxidase.Circulation，2004，109(2):227-233

2 Sorescu D，Weiss D，Lassegue B，et al.Superoxide production and expression of NOX family proteins in human atherosclerosis.Circulation，2002，105(12):1429-1935

3 林宜，朱斌.NAD(P)H氧化酶与肾脏病关系及其研究进展.医学研究杂志，2007，36(1):99-100

4 Groemping Y，Lapouge K，Smerdon SJ，et al.Molecular basis of phosphorylation-induced activation of the NADPH oxidase.Cell，2003，113:343-355

5 丁莉，屈顺林，王蕾，等.高葡萄糖刺激血管内皮细胸尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调，活性氧增加及细胞凋亡.中国动脉硬化杂志，2007，15(6):405-409

6 Silver AE，Beske SD，Christou DD，et al.Overweight and obese humans demonstrate increased vascular endothelial NAD(P)H oxidasep47(phox)expression and evidence of endothelial oxidative stress.Circulation.，2007，115(5):627-663

7 Xia L，Wang H，Goldberg HJ，et al.Mesangial cell NADPH oxidase upregulation in high glucose is protein kinase C dependent and required for collagen IV expression.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(2):F345-356

8 Li JM，Shah AM.Mechanism of Endothelial Cell NADPH Oxidase Activation by Angiotensin II.The Journal of Biological Chemistry，2003，278(14):2094-2100