红花注射液对大鼠周围神经缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

彭其胜（重庆市涪陵中心医院，重庆市 408000）

周围神经缺血再灌注（IR）损伤在临床上较常见，多继发于创伤、血栓形成、断肢再植、筋膜间隙综合征、肢体大动脉损伤以及较长时间应用止血带等造成周围神经缺血，在恢复血流灌注后不仅不能改善神经功能，反而进一步加重组织损伤[1]。

红花（Carthamus tinctorius），又叫草红、刺红花、杜红花、金红花，为菊科植物红花的管状花。红花是一味传统的活血祛瘀中药，研究发现，其具有扩张血管、改善微循环、抗炎、清除自由基等功能[2]。红花注射液为红花经现代制药工艺分离提取制备而成，临床上多用于心脑血管疾病和糖尿病周围神经炎的治疗。动物研究发现，红花注射液对肠IR损伤具有保护[3]，能否将红花注射液用于周围神经IR损伤尚未见报道。本研究拟采用周围神经IR大鼠模型，初步探讨红花注射液在周围神经IR损伤中的保护作用及其机制，为临床防治周围神经IR损伤提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

3K30型超低温离心机（德国Sigma公司）；550型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；UV-265紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；Evomatic-8000诱发型电位仪（丹麦Dantec公司）；电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国PE公司）。

1.2 试药

红花注射液（雅安三九药业有限公司，批号：100105，规格：5 mL/支）；20%甘露醇注射液（石家庄四药有限公司，批号：101105235，规格：50 g∶250 mL）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫法（ELIA）试剂盒购自天津康尔克生物科技有限公司。

1.3 动物

Ⅰ级纯种SD大鼠，♂，体重180～200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 复制周围神经IR模型

参照文献[4]复制周围神经IR模型。SD大鼠以4%水合氯醛ip麻醉，固定，剪开一侧腹股沟部皮肤，用10 g捏持力的无损伤动脉夹阻断髂总动脉起始处，再用2个同样的动脉夹夹于髂内、髂外动脉的起始处，静脉血管不予阻断，6 h后松开动脉夹，恢复血流。对照大鼠仅分离暴露髂总动脉、髂内动脉和髂外动脉6 h。

2.2 分组和给药

30只大鼠随机分为对照（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、甘露醇（20%，5 mL·kg-1）和红花注射液高、中、低剂量（32、16、8 mL·kg-1）组。除对照组外，各组分别于恢复血流灌注同时尾iv相应药物。再灌注6 h后处死大鼠检测各项指标。

2.3 肢体功能评估方法

参照Kinnoshitam Y等[5]的量化评估系统评估患肢功能，分值越高功能越差。

2.4 SOD活性检测

分离坐骨神经，制备10%组织匀浆，4℃下、4000 r·min-1离心20 min，保留上清液，备用。按照SOD试剂盒说明书方法测定SOD活性。

2.5 MDA含量检测

分离坐骨神经，制备10%组织匀浆，4℃下、4000 r·min-1离心20 min，保留上清液，备用。按照MDA试剂盒说明书测定MDA含量。

2.6 ELISA法检测TNF-α水平

分离坐骨神经，制备10%组织匀浆，4℃下、4000 r·min-1离心20 min，保留上清液，备用。按照ELISA试剂盒说明书方法测定TNF-α水平。

2.7 神经电生理指标检测

近端电极置于坐骨神经膝上4 cm，远端置腓总神经膝下1 cm，接收电板置于胫骨前肌，实验中电极位置不变。连续动态观察运动神经传导速度、动作电位波幅、潜伏期的变化。再灌注5 h后，每15 min记录1次，取其平均值。

2.8 电感耦合等离子体原子发射光谱法检测坐骨神经钙离子水平

将坐骨神经置于1.0 mL浓硝酸，室温消化1 h后放入65℃烤箱，4 h后加入5 mL去离子水，1500 r·min-1离心5 min。取上清液，于422.7 nm波长处检测钙离子水平。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 红花注射液对模型大鼠肢体功能评分的影响

模型组大鼠肢体功能评分较对照组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，甘露醇和红花注射液高、中剂量组肢体功能评分显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。红花注射液对模型大鼠肢体功能评分影响见表1。

表1 红花注射液对模型大鼠肢体功能评分的影响（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

表1 红花注射液对模型大鼠肢体功能评分的影响（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别对照组模型组甘露醇组红花注射液低剂量组红花注射液中剂量组红花注射液高剂量组肢体功能评分0±010.63±1.74＊7.29±1.19#11.07±1.817.54±1.24#5.52±0.90##

3.2 红花注射液对模型大鼠坐骨神经SOD和MDA的影响

与对照组比较，模型组SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，甘露醇和红花注射液高、中剂量组SOD活性显著升高（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。红花注射液对模型大鼠坐骨神经SOD和MDA的影响见表2。

表2 红花注射液对模型大鼠坐骨神经SOD和MDA的影响（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表2 红花注射液对模型大鼠坐骨神经SOD和MDA的影响（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

MDA/nmol·mg-1 12.66±2.7731.50±3.59＊23.06±2.62#29.22±3.3221.87±3.94#18.61±2.12#组别对照组模型组甘露醇组红花注射液低剂量组红花注射液中剂量组红花注射液高剂量组SOD/U·mg-1 186.41±23.68107.57±15.43＊139.31±20.17#112.48±20.32128.09±23.14#157.24±28.11##

3.3 红花注射液对模型大鼠坐骨神经TNF-α的影响

与对照组比较，模型组TNF-α显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，红花注射液高剂量组TNF-α显著降低（P＜0.05）。红花注射液对模型大鼠坐骨神经TNF-α的影响见表3。

3.4 红花注射液对模型大鼠神经电生理的影响

与对照组比较，模型组神经潜伏期显著延长，神经传导速度和波幅显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，甘露醇和红花注射液高剂量组神经潜伏期显著缩短，神经传导速度和波幅显著增加（P＜0.01或P＜0.05）。红花注射液对模型大鼠神经电生理的影响见表4。

表3 红花注射液对模型大鼠坐骨神经TNF-α的影响（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表3 红花注射液对模型大鼠坐骨神经TNF-α的影响（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

模型组甘露醇组红花注射液低剂量组红花注射液中剂量组红花注射液高剂量组5.37±1.7210.54±1.41＊9.13±1.099.21±1.248.62±1.125.58±0.95#TNF-α/ng/L-1

表4 红花注射液对模型大鼠神经电生理的影响（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

表4 红花注射液对模型大鼠神经电生理的影响（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

波幅/mV 9.76±1.641.98±0.45＊4.71±0.79#2.32±0.395.31±0.77#6.54±0.88##组别对照组模型组甘露醇组红花注射液低剂量组红花注射液中剂量组红花注射液高剂量组潜伏期/ms 1.37±0.255.15±0.76＊3.81±0.41#4.94±0.624.02±0.532.96±0.37#传导速度/m·s-1 42.52±6.1322.14±4.29＊30.58±4.51#19.63±3.8327.72±3.7935.03±5.75##

3.5 红花注射液对模型大鼠神经钙离子的影响

与对照组比较，模型组坐骨神经钙离子含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，甘露醇和红花注射液高剂量组坐骨神经钙离子含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。红花注射液对模型大鼠坐骨神经钙离子的影响见表5。

表5 红花注射液对模型大鼠坐骨神经钙离子的影响（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表5 红花注射液对模型大鼠坐骨神经钙离子的影响（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

钙离子/μg·g-1 19.46±3.1681.11±10.92＊54.07±8.28#86.42±12.6361.73±9.3147.81±7.64##分组对照组模型组甘露醇组红花注射液低剂量组红花注射液中剂量组红花注射液高剂量组

4 讨论

周围神经组织由于血供丰富、耗氧量低，且能迅速适应无氧代谢，故较少发生IR损伤。但随着车祸伤、机械切割伤等易致肢体长时间缺血缺氧损伤发生率的不断提高，对于周围神经IR损伤的防治也日益受到重视。

研究认为，周围神经IR主要损伤不是发生于缺血期间，而是在血液灌注恢复，氧分子重新进入组织后[6]。在正常生理条件下，由于机体有强大的自由基防御系统，可将产生的自由基及时清除。而IR时抗氧化物质在缺血期间已被大量消耗灭活，血流恢复时自由基产生急剧增加，清除能力却显著下降，造成自由基的堆积。自由基可直接攻击神经髓鞘髓磷脂，造成脂质过氧化损伤，导致髓鞘水肿，细胞膜通透性增加[7]。随着细胞膜通透性升高，钙离子内流随之升高，细胞内出现钙超载，钙超载可进一步加重细胞内氧化应激失衡，形成氧化应激失衡与钙超载的恶性循环[8]。MDA水平可反映机体氧自由基水平，SOD则是抗氧化应激系统的重要组成部分，通过检测MDA和SOD水平可以初步评价机体氧化应激平衡系统。此外，研究认为细胞因子也参与了周围神经IR的病理生理进程。在周围神经IR损伤部位发现了炎性细胞、巨噬细胞和淋巴细胞及其相关细胞因子。相关研究也显示，在周围神经IR损伤部位，促炎因子TNF-α表达增加[9]。

本实验结果表明，模型组大鼠肢体功能和神经电生理指标显著减退，表明IR导致大鼠坐骨神经组织机构和功能受损。MDA、TNF-α和钙离子水平随之显著升高，SOD活性显著降低，则提示氧化应激平衡失调、钙超载和炎症反应参与了周围神经IR损伤，与文献报道一致。红花注射液和甘露醇均能降低坐骨神经组织MDA和钙离子含量，升高SOD活性，显著改善大鼠肢体功能评分和神经电生理指标。与甘露醇比较，红花注射液还能明显降低TNF-α浓度，表明红花注射液抗炎作用强于甘露醇。同时实验数据显示，红花注射液的上述作用具有剂量依赖性。

本研究表明，红花注射液对周围神经IR损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制氧化应激、抗炎和减少钙离子内流有关。

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[2]冯 涛，阎婷婷，阎国荣，等.红花提取物清除自由基能力的初步研究[J].天津农学院学报，2010，17（1）：6.

[3]高永刚，王宏磊，武继军.红花注射液复合黄芪注射液对大鼠肠缺血再灌注损伤的实验研究[J].时珍国医国药，2010，21（8）：1944.

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[9]Wang Y，Kawamura N，Schmelzer JD，et al.Decreased peripheral nerve damage after ischemia-reperfusion injury in mice lacking TNF-alpha[J].J Neurol Sci，2008，267（1-2）：107.