钙通道阻滞剂对大鼠坐骨神经嵌压性损伤早期c-fos表达及神经病理变化的影响

徐长中，吴 乐，唐金荣，苏建华，肖 杭

(1南京医科大学第一附属医院，南京210029;2灌南县人民医院;3南京医科大学神经毒理研究所)

c-fos是第三信使，可在神经细胞表达。以往认为，神经干损伤早期c-fos表达增加是参与冲动传导轴突对伤害性刺激的反应［1］;采用一定形式刺激神经干，检测c-fos表达部位及程度，可了解神经受损状态［2］。研究证实，刺激兴奋性氨基酸受体可增加Ca2+通道开放，增加Ca2+内流;不同性质的致病因子最终均可导致第二信使Ca2+内流，使神经细胞功能受损［3］。早期使用钙通道阻滞剂(CCB)可保护受损细胞的重要功能［4］，但其确切机制不明。2003～2005年，为探讨CCB对大鼠坐骨神经损害的保护机制，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物及试剂 SD大鼠288只，雌雄各半，体质量180～220 g，由上海斯莱克实验动物公司提供。禁食12 h后，按体质量随机分为对照组(A组)、生理盐水组(B组)、氟桂利嗪低剂量组(C1组)与高剂量组(C2组)各72只。CCB为氟桂利嗪(西安杨森)，试剂为Trizol试剂(Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(Promega公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 周围神经损伤模型制作 模型制作前30 min，C1组、C2组分别腹腔注射氟桂利嗪1、2 mg/kg，B组注射等量生理盐水。大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，于右后肢后侧切开，钝性分离肌肉组织，暴露坐骨神经。其中A组在坐骨神经暴露后关闭切口;其余三组用大鼠平均体质量1/2的压力夹住，持续30 s后松开，关闭切口。各组均注射抗生素预防感染。

1.2.2 背根神经节(DRG)、坐骨神经干分离 在实验0、5、15、30 min，1、2、4、24 h 及4 周时分别快速处死大鼠8只，取出胸腰段脊柱。从脊柱正中剖为两半，置于pH 7.4、渗透压340 mOsm/L的DMEM液培养皿内。遂即从椎管内侧取出脊髓、神经节、相连的神经前后根和坐骨神经干，在显微镜下用精细角膜剪及游丝镊剪除与神经干相连的周围结缔组织膜。

1.2.3 c-fos mRNA检测 嵌压大鼠坐骨神经后0、5、15、30 min 及1、2、4、24 h 取各组 DRG，按试剂盒操作说明提取DRG RNA。采用RT-PCR方法检测c-fos mRNA，引物序列:c-fos上游为5'-ATGATGTTCTCGGGTTTCAA-3'，下 游 为 5'-TGACATGGTCTTCACCACTC-3'，扩增片段长度为348 bp;c-jun上游为 5'-ATGACTGCAAAGATGGAAAC-3'，下游为 5'-TTGAAGTTGCTGAGGTTGG-3'，扩增片段长度为530 bp。内对照β-actin引物由北京三博远志生物公司合成，扩增片段长度为877 bp。将提取后的RNA在70℃孵育10 min后置于冰上备用，配制RT反应液20 μl，按 30 ℃ 10 min、42 ℃ 5 min、95 ℃ 5 min、5℃5 min进行逆转录。RT完成后配制PCR反应液，按95 ℃预变性2 min、95 ℃变性1 min、55.5 ℃(c-fos)/56℃(c-jun)退火1 min、72℃延伸1 min进行扩增，共循环35次，最后72℃延伸2 min。反应完毕，将PCR产物加入加样缓冲液，置1%琼脂糖凝胶、80 V恒压电泳30 min后，在紫外光灯下进行阳性条带密度扫描，计算c-fos mRNA表达水平。RT-PCR结果经图像分析软件作半定量分析。

1.2.4 DRG的病理学检测 第4周末处死各组大鼠，按本文1.2.2方法取出其DRG及坐骨神经，在光镜下检查其病理变化。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据用±s表示，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-fos mRNA表达 各组0、5、15 min时的c-fos mRNA表达无统计学差异(P均 ＞0.05);其0、30 min及1、2 h的c-fos mRNA表达见表1。

表1 各组0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表达(±s)

表1 各组0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表达(±s)

注:与同组0 min比较，*P ＜0.05;与 A组同期比较，△P ＜0.01;与 B 组同期比较，#P ＜0.01;与 C1组同期比较，▲P ＜0.05

检测时间 A组(n=8) B组(n=8) C1组(n=8) C2组(n=8)0 min 18.875 ±3.271 18.750 ± 3.694 18.375 ±3.73919.000 ±4.106 30 min 19.000 ±3.665 53.250 ±11.817＊△ 47.000 ±4.876＊△# 34.375 ±6.255＊△#▲1 h 18.250 ±3.882 61.250 ±12.646＊△ 50.125 ±9.761＊△# 37.125 ±9.598＊△#▲2 h 18.375 ±4.868 47.375 ±10.623＊△ 38.500 ±7.407＊△# 30.250 ±8.049＊△#▲

2.2 DRG的病理改变 A组未见明显病理改变。B组表现为众多细胞核电子密度减低，核仁、核结构消失，空泡变性，核膜不完整;胞质中电子密度增加，片块状均质性变和空泡变性;可见凋亡小体。C1组、C2组表现为少数细胞核电子密度减低，核仁、核结构消失，空泡变性，核膜不完整;胞质中电子密度增加，片块状均质性变和空泡变性;偶见凋亡小体。C2组病变轻于C1组。

3 讨论

研究发现，c-fos表达升高是参与冲动传导轴突对伤害性刺激的反应［1］;压迫L5神经根可致c-fos表达升高［5］;阻断 N-甲基-D-天冬氨酸门控型及 L型 Ca2+通道可下调新纹状体早期 c-fos表达［6］;CCB及细胞内Ca2+螯合剂可使大脑皮质细胞损伤后大鼠早期c-fos表达下调。本研究显示，嵌压大鼠坐骨神经干后，其c-fos表达升高后迅速下降;与B组比较，C1、C2组的c-fos mRNA及c-fos蛋白表达降低，以C2组显著;其可能机制是Ca2+激活或上调c-fos表达，而CCB氟桂利嗪阻断了Ca2+内流，故使早期DRG细胞c-fos表达下调。本研究结果与文献报道［1～3］相近。Patro等发现，氟桂利嗪能使大鼠DRG神经元丢失明显减少。本研究显示，CCB可减轻大鼠急性坐骨神经嵌压性损伤后的病理损害，促进神经损伤修复;结果与Patro等报道相近。本研究还显示，大鼠坐骨神经嵌压性损伤早期，c-fos表达可影响后期的病理学变化和神经传导恢复，c-fos表达愈高，病理损害愈重;氟桂利嗪预处理后其病理变化和神经传导改善明显，可能与CCB阻断Ca2+内流，使早期c-fos表达下调有关。

既往研究发现，利用一定形式刺激神经干，通过检测c-fos表达的部位及程度可了解其神经受损状态［3］。Matthews等［7］指出，电压依赖性 Ca2+通道活性是维持神经递质释放和神经元兴奋性的关键，早期使用CCB可保护受损神经元的重要功能。本研究显示，大鼠坐骨神经嵌压性损伤早期Ca2+内流致c-fos表达上调，及早应用CCB可下调其神经细胞cfos表达，从而减轻神经病理损害，起到神经保护作用。

［1］Narita M，Ozaki S，Narita M，et al.Change in the expression of cfos in the rat brain following sciatic nerve legation［J］.Neurosci Lett，2003，352(3):231-233.

［2］Kominato Y，Tachibana T，Dai Y，et al.Change in phosphorylation of ERK and Fos expression in dorsal horn neurons following noxious stimulation in a rat model of neuritis of the nerve root［J］.Brain Res，2003，967(1-2):89-97.

［3］杨大志，王坤正，陈君长，等.神经根嵌压伤中原癌基因形态蛋白和降钙素基因相关肽的表达［J］.中华外科杂志，2004，42(20):1236-1239.

［4］MacDonald JF，Xiong ZG，Jackson MF.Paradox of Ca2+signaling，cell death and stroke［J］.Trends Neurosci，2006，29(2):75-81.

［5］Tang JG，Chen HS，Yuan W，et al.The role of capsaicin-sensitive primary afferents in experimental sciatica induced by disc herniation in rats［J］.Spine，2008，33(2):163-168.

［6］Lee J，Rushlow WJ，Rajakumar N.L-type calcium channel blockade on haloperidol-induced c-Fos expression in the striatum［J］.Neuroscience，2007，149(3):602-616.

［7］Matthews EA，Dickenson AH.Effects spinally delivered N-and ptype voltage-dependent calcium channel antagonists on dorsal horn neuronal responses in a rat model of neuropathy［J］.Pain，2001，92(1-2):235-246.