广西肺鳞状细胞癌RASSF1A及RPRM基因甲基化分析

冯 旭，覃家锦，周华富，郑宝石，何 巍

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

基因的失活方式有很多，而启动子CpG岛的异常甲基化受到越来越多的重视［1］，最近研究证实启动子CpG岛甲基化可能在非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展过程中发挥重要作用并且是导致抑癌基因失活的重要机制［2］。2009年9月～2010年7月，我们通过检测和比较RASSF1A和RPRM肺癌相关基因启动子CpG岛甲基化在肺鳞状细胞癌组织以及良性肺部疾病肺组织中的发生频率，建立广西肺鳞状细胞癌相关较为完整的甲基化谱，为临床早期诊断广西肺鳞状细胞癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 肺癌组为2008年9月～2009年6月在我院住院的广西肺鳞状细胞癌患者30例，其中男21 例、女9 例，年龄(52.3 ±1.2)岁，均经病理确诊。对照组为良性肺部疾病患者20例，其中男15例、女5例，年龄(46±1.25)岁，自发性气胸12例，肺囊肿8例。

1.2 标本采集与处理 肺癌组取手术中病理组织标本及癌旁正常组织，对照组取手术中组织标本，立刻置于液氮罐内，置－80℃低温冰箱待检。

1.3 甲基化特异性PCR(MSP)方法检测RASSF1A及RPRM ①标本细胞株DNA提取。用1 ml PBS悬浮沉淀物，转移入1.5 ml的离心管中，离心/去上清后，加入细胞裂解液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，25 mmol/L EDTA 0.2 ml，0.5%SDS)和终浓度为200μg/ml的proteinase K 0.2 ml。于50℃温育2 h后，酚/氯仿抽提2次，通过酒精沉淀获取DNA。加入0.3ml10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH7.5溶解，定量后置－20℃保存。②DNA非甲基化胞嘧啶的处理。亚硫酸氢钠处理:每个样品DNA取2μg，加入 ddH2O至总体积20μl，加入3 mol/L NaOH 2.2μl轻轻混匀后置37℃水浴15 min，以使基因组DNA充分变性，分别加入新鲜配制的对苯二氢醌12μl和NaHSO3208μl，混匀后覆盖消毒后的矿物油快速离心后，50℃反应16 h，使未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。接着加1μl糖原、8.0 mol/L NH4Ac 44μl及无水乙醇350μl混匀后，13 000 r/min离心6 min，弃去上清液，得到沉淀的DNA甲基化后的反应物，用75%乙醇洗涤沉淀2次，空气中稍干燥，溶解于200μl ddH2O，置－20℃下保存待检测。③甲基化后DNA的PCR。按每管中加入2 μl 2 mmol/L dNTP、2 μl 10 ×Buffer、15 μl ddH2O乘以PCR样本数，在冰浴状态下加0.12μl Taq酶，轻轻混匀以免降低酶的活性。加入甲基化(M)和去甲基化引物(U)各2μl，轻轻混匀后，加入ddH2O至24μl/管加入到PCR 8连管中，最后加入1 μl处理后DNA模板。④PCR后DNA产物甲基化状态的检测。在200～210 V电压下电泳12 min，PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分离，其结果在紫外凝胶成像系统观察分析并拍照存档。然后均将PCR产物割胶回收，经测序来证明PCR产物的正确性。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0进行 χ2检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

RASSF1A基因和RPRM基因电泳图分别见图1、2。肺癌组 RASSF1A基因甲基化率为 83.3%(25/30)，RPRM基因甲基化率为70%(21/30);对照组RASSF1A基因均呈去甲基化，甲基化率为0，RPRM基因甲基化率为10%(2/20)。肺癌组RASSF1A基因与RPRM基因甲基化率与对照组比较均有统计学差异(P＜0.01)。

图1 RASSF1A基因电泳图

图2 RPRM基因电泳图

3 讨论

现代分子生物学认为，肿瘤是一种多基因改变、多步骤发生的全身性疾病，基因的改变在细胞水平表现为细胞周期失常，癌基因的突变或过度表达导致促细胞通路过度活化，引起细胞增殖，肺癌也不例外。虽然经过多年的研究，耗费大量时间和经费，却发现在相当一部分肿瘤患者的癌细胞中，其主要的基因是完整的，并没有发现任何突变或缺失等基因变异。更精确、便利的肺癌早期诊断和预后判断的手段是我们追求的目标。

表观遗传学丰富了 Knudson［3］两次打击学说，此学说认为抑癌基因的失活应当包括两个等位基因的共同改变，其中一个等位基因出现杂合性缺失(LOH)，表现为抑癌基因失活可以参与第1、2次打击，包括基因组水平改变如基因突变和染色体缺失完成以及启动子区高甲基化，并能通过维持型甲基化酶DNMT1，使特定甲基化模式在细胞世代间遗传;另一个发生突变或甲基化使基因失表达，该基因无表达活性，表明两者在肿瘤形成中有相同的生长优势。因此DNA甲基化使抑癌基因沉默在肿瘤发生发展中具有重要意义，另外认为肿瘤相关基因DNA甲基化改变是肿瘤发生发展中的早期频发事件。因此DNA异常甲基化的检测已成为探讨肿瘤发生机制新的分子分析热点。

基因特别是抑癌基因的甲基化是NSCLC预后较差的一个分子信号，Burbee 和 Brabender等［4，5］分别报道发生RAASF1a和RPRM高度甲基化的NSCLC患者的生存期较无甲基化者明显缩短。余宗涛等［6］发现肺癌组织和外周血浆、支气管肺泡灌洗液中RASSF1A基因启动子异常甲基化率为53.3%，非肺癌患者中未检出甲基化。本实验结果发现，肺鳞状细胞癌 RASSF1A基因甲基化率为83.3%，RPRM基因其甲基化率为70%，均明显高于对照组。证实了在广西肺鳞状细胞癌中两种抑癌基因RASSF1A及RPRM有较高的甲基化率，为临床上早期诊断肺癌并预测患者的预后提供重要的理论依据。

［1］Li E，Beard C，Jaenisch R.Role for DNA methylation in genomic imprinting［J］.Nature，1993，366(6453):362-365.

［2］Jaenisch R.DNA methylation and imprinting:why bother［J］.Trends Genet，1997，13(8):323-329.

［3］Knudson AG.Two genetic hits(more or less)to cancer［J］.Nat Rev Cancer，2001，1(2):157-162.

［4］Burbee DG，Forgacs E，Zochbauer-Muller S，et al.Epigenetic inactivation of RASSF1a in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression ［J］.JNatl Cancer Inst，2001，93(9):691-699.

［5］Brabender J，Usadel H，Danenberg KD，etal.Adenomatous polyposis coligene promoter hypermethylation in non-small cell lung cancer is associated with survival［J］.Oncogne，2001，20(27):3528-3532.

［6］余宗涛，袁亚莉，张吉才，等.肺癌患者Ras相关区域家族1A基因启动子异常甲基化的检测［J］.临床内科杂志，2007，24(1):23-24.