IVF失败者子宫内膜galectin-3表达及其容受性评估

赵世彬，甄秀丽*，孙海茹，张 娜，乜照燕，张 轶

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011;2衡水哈励逊国际和平医院)

目前体外受精—胚胎移植(IVF)妊娠率不断提高，但有患者胚胎评分好仍不能妊娠。这使人们对不孕症患者着床方面的缺陷越来越重视，着床时胚胎和子宫内膜的同步发育与相互配合是很重要的，其中，子宫内膜的接受性又是一个关健性因素，自然成为一个研究热点。使用抑制性消减杂交技术［1］(SSH)对差异表达基因片段进行测序，建立了与子宫内膜容受性相关的差异表达基因文库，筛选出与子宫内膜容受性相关基因，如galectin-3等。本研究通过检测galectin-3在IVF失败患者子宫内膜中的表达，探讨子宫内膜容受性的分子基础，为提高IVF妊娠率提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1～4月在河北医科大学第四医院生殖医学科行IVF失败患者11例作为研究组，不育原因为输卵管因素9例，子宫内膜异位症2例。对照组为10例同期行IVF妊娠者，前一周期排卵后6～7 d着床窗口期子宫内膜采用逆转录PCR(RT-PCR)技术和免疫组化技术检测内膜galectin-3表达。患者年龄24～39岁，不孕年限2～10 a。所有入选病例均符合以下条件:排卵前子宫内膜厚度≥8 mm;形态三线或接近三线。

1.2 研究方法

1.2.1 子宫内膜采集 选取有IVF指证者于IVF前一月经周期第10～11日开始监测卵泡，阴道B超采用日本ALOKA公司α-5彩色超声仪，阴道探头频率为5 MHz。排卵后6～7 d用内膜取样器采集子宫内膜部分液氮保存用于mRNA测定，部分4%甲醛固定用于免疫组化检测。

1.2.2 控制性超排卵 排卵后6～7 d(黄体中期)给予醋酸曲普瑞林(德国辉凌制药)0.1 mg/d，达到降调节标准后给予促性腺激素(Gonal-F，瑞士serone公司;hMG，丽珠制药)，采用经阴道超声监测子宫内膜变化和卵泡生长情况，当至少有3个卵泡直径＞18 mm时，当晚注射艾泽(瑞士serone公司)250 IU，注射后38 h左右取卵，体外受精，于取卵后3 d胚胎移植，移植后21 d B超子宫内看到孕囊为临床妊娠。

1.2.3 子宫内膜RT-PCR检测技术 分别取研究组及对照组子宫内膜各约50 mg加入Rezol 1 ml置匀浆器内充分匀浆，提取总RNA，取出1.5μg，进行反转录得cDNA，继而进行PCR扩增。galectin-3上游引物序列为:5'-GAATGATGTCTTCCAC-3'，下游引物序列为:5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCAC-3'，扩增片段长度为278 bp。同时以扩增片段长度为540 bp的β-actin作为内参照。PCR循环条件为:94℃5 min，1 个循环;94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30个循环;72℃ 10 min，1个循环。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用VDS图像分析系统进行照相和图像分析。IOD值经内参照校正，将校正值进行统计学分析。Rezol及反转录试剂盒均为北京赛百盛公司产品，galectin-3、β-actin引物由博亚生物技术公司设计，上海生工生物技术公司合成。

1.2.4 免疫组化检测 galectin-3鼠单克隆抗体IgG1为CWBIO公司产品。二抗为通用型试剂盒。将子宫内膜用4%甲醛固定后石蜡包埋，制备2μm厚连续组织切片。分别进行HE和ABC免疫组化染色。脱蜡、消化、高压抗原修复、封闭、加入一抗(单克隆小鼠抗人galectin-3稀释浓度为1∶100)、二抗、DAB显色、苏木素复染、脱水后透明、中性树胶封片。用PBS代替一抗做阴性对照。显微镜观察并拍照。阳性判断标准:每张染色片随机选取5个视野，以背景清晰、细胞质着色呈棕黄色为阳性，分为4个等级:细胞均无任何阳性染色为“－”;25%以下细胞阳性染色为“+”;25% ～50%细胞阳性染色为“++”;50%以上细胞阳性染色“+++”。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验;计数资料采用χ2检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况比较 研究组与对照组年龄、不育年限、Gn天数、获卵数、优胚数等均无统计学差异，见表1。

表1 研究组与对照组一般资料比较(±s)

表1 研究组与对照组一般资料比较(±s)

获卵数 优胚数研究组 29.22 ±4.16 5.12 ±3.16 10.54 ±2.81 11.26 ±2.73组别 年龄(岁)不育年限(a)Gn天数(d)5.32 ±3.13对照组 28.41 ±4.15 4.98 ±4.44 10.44 ±3.13 11.55 ±2.275.19 ±4.25

2.2 galectin-3 mRNA的表达 见图1。PCR半定量分析结果显示，galectin-3 mRNA在研究组和对照组分别为0.11 ±0.18 和0.42 ±0.37，P ＜0.01。

图1 2组着床窗口期子宫内膜galectin-3 mRNA表达比较

2.3 galectin-3蛋白的表达 galectin-3蛋白在腺体上皮细胞和基质细胞均有表达，研究组的表达为“－”，对照组的表达为“++”。

3 讨论

胚胎着床的成功依赖于子宫内膜和胚胎的同步发育，子宫内膜仅在特定而短暂的时期允许胚胎着床，这一时期被称为“着床窗口期”，人类胚胎着床窗口期在排卵后第6～8天，即分泌中期。子宫内膜容受性是受到母体激素作用下子宫内膜局部因子的一系列时序性表达的基因调控，已经发现一些基因与子宫内膜容受性建立有关，如细胞因子、黏附分子、糖复合物等。

在对胚泡着床的研究过程中，糖蛋白复合物的作用一直颇受重视，人们认为这类物质可以调节子宫内膜的增殖、分化、迁移及黏附能力，而且胚胎和子宫内膜的相互识别过程也可能通过糖复合物及其配体的相互作用建立。galectins是糖结合蛋白的一个家族，galectin-3是该家族的主要成员之一［2］，这类分子一方面通过与配体结合调节细胞生长、黏附和侵袭，同时又具有调节整联蛋白与细胞外基质分子的亲和力的作用，galectin-3可与整联蛋白α1β1结合［3］。雷彩霞等［4］发现应用 RNA 干扰技术(siRNA)抑制gelectin-3表达后，人类子宫内膜上皮细胞株RL95-2细胞G1期上升，S期下降;整联蛋白β1表达下降;对细胞外纤维黏连蛋白黏附性显著降低。von Wolff等报道galectin-3在人类分泌期子宫内膜表达最高［5］，提示gelectin-3参与子宫内膜功能和胚胎植入的调节。杜国平等［6］进一步证实gelectin-3 mRNA和蛋白在分泌中期子宫内膜的表达高于增生晚期，提示galectin-3可能参与了生殖过程的调节，与子宫内膜容受性和胚胎的植入有关。

本研究结果显示，子宫内膜中galectin-3 mRNA和蛋白表达在IVF失败患者明显低于妊娠组，可见IVF失败患者胚胎着床障碍是主要原因之一。

［1］杜国平，张炜，王丽，等.着床窗口期子宫内膜差异表达基因的研究［J］.中华妇产科杂志，2007，42(3):187-191.

［2］Dumic J，Dabelic S，Flogel M.Galectin-3:an open-ended story［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1760(4):616-635.

［3］Ochieng J，Leite-Browning ML，Warfield P.Regulation of cellular adhesion to extracellularmatrix proteins by galectin-3［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，246(3):788-791

［4］雷彩霞，张炜，孙晓炜，等.Galectin-3表达抑制对子宫内膜上皮细胞生长周期和黏附性的影响［J］.复旦学报(医学版)，2007，34(2):169-175.

［5］von Wolff M，Wang X，Gabius HJ，et al.Galectin fingerprinting in human endometrium and decidua during themenstrual cycle and in early gestation［J］.Mol Hum Reprod，2005，11(3):189-194.

［6］杜国平，张炜，王丽，等.凝集素半乳糖结合蛋白3在人子宫内膜的表达［J］.复旦学报(医学版)，2006，33(2):143-146.