干燥综合征模型小鼠涎腺AQP1、AQP5表达的研究

(贵阳中医学院第二附属医院，贵阳550003)

干燥综合征(SS)是一种侵犯涎腺、泪腺等外分泌腺为主的自身免疫性疾病，发病机制仍不清楚，近年来国外研究显示水分子通道蛋白(AQP)可能与SS发病有关［1］。AQP1和 AQP5在涎腺、泪腺组织中高表达，与SS涎腺、泪腺损伤及唾液、泪液量的分泌密切相关。2009年9月～2010年3月，我们根据文献建立 SS 模型小鼠［2，3］，检测其 AQP1 和 AQP5的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择BALB/C小鼠40只，SPF级，雌性，体质量20 g左右。购自重庆医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 百白破疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司;弗氏完全佐剂(Sigma，USA);考马斯亮兰试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TRIzol(Invitrgen，USA);RT-PCR试剂盒购自凯基生物。引物购自上海捷瑞生物工程有限公司，AQP1上游引物 CTGGCCTTTGGTTTGAGCAT，下游引物 CCACACACTGGGCGATGAT，扩增片段长度为149 bp;AQP5上游引物GCGCTCAGCAACAACACAAC，下游引物 GTGTGACCGACAAGCCAATG，扩增片段长度为149 bp。

1.3 动物模型的建立 将BALB/C小鼠随机分成模型组和空白组，每组15只。取10只同种小鼠，无菌条件下取颌下腺，匀浆后，测定抗原浓度2 171 μg/ml，加 PBS 缓冲液稀释到 1 000 μg/ml，加入同体积弗氏完全佐剂，最后浓度为500μg/ml，每只小鼠背部多点注射抗原，总量为1ml/只。同时背部注射百白破疫苗0.5 ml，产生类似于人类SS的唾液腺改变及临床表现特点。

1.4 观察方法 于造模后每周观察SS小鼠体质量、摄食量、饮水量和唾液腺分泌功能的测定。4周后(每组随机抽取10只作为实验对象)用湿重法测量唾液流率，记录1周的总饮水量后杀鼠，取出涎腺标本，HE染色后病理检测，光镜下观察淋巴细胞浸润。免疫组化 SP法测定 AQP1、AQP5的表达［4］。提取总 RNA，RT-PCR对 AQP1、AQP5的 mRNA进行定量分析，AQP1、AQP5 mRNA的表达以它们与β-actin扩增产物的吸光度比值表示每份标本的相对mRNA水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据以±s表示，采用t检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 病理观察 空白组小鼠颌下腺组织腺泡大小均匀，腔内充满分泌液，无炎症细胞浸润，导管排列整齐，无扩张。模型组细胞间隙扩大，间质有淋巴细胞浸润，腺泡大小不等，腺体萎缩，有毛细血管扩张充血，并可见少量纤维组织。

2.2 免疫组化结果 空白组小鼠颌下腺AQP1和AQP5均见较多腺泡的顶膜、侧膜、基膜和分泌管、导管上皮内均有较强染色的棕黄色颗粒。模型组AQP1亦见棕黄色颗粒，但染色较空白组浅，两者相比较差异不大，而AQP5在模型组腺泡、分泌管、导管等处染色减弱或消失。

2.3 AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表达 见表1。

表1 两组AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表达比较(±s)

表1 两组AQP1 mRNA、AQP5 mRNA的表达比较(±s)

注:与空白组比较，*P ＜0.01

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3 讨论

SS患者在静息和刺激状态下唾液流率均降低，可以导致言语困难、进食障碍、口腔念珠菌病、猖龋齿和慢性涎腺炎等一系列病变。传统观点认为是由于SS患者涎腺组织中促炎因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等过度表达导致腺体组织的破坏［5］。目前较多的研究认为SS腺泡细胞内的液体分泌与电解质的活跃转运及水分子的流动之间的渗透性偶联相关［6］，而AQP在此过程中可能发挥了重要作用。

在已知的AQP家族中，分布于哺乳动物涎腺的有 AQP1、AQP2、AQP3、AQP4 和 AQP8［1］，其中 AQP1和AQP5在涎腺组织中高表达与唾液量的分泌密切相关，在某些涎腺疾病如SS及其病理过程中发挥了重要作用［7］。但只有AQP5在涎腺分泌细胞中的分布被接受，AQP5最初是从大鼠颌下腺的cDNA文库中扩增出来的，敲除AQP5基因的小鼠所表现出来的低水平的唾液分泌速度和低分泌量的高渗性唾液均支持AQP5在涎腺功能的正常运作中具有其特定的生理作用［8］。对AQP在人涎腺中的作用还了解的很少，AQP1在肌上皮细胞表面的表达也许可以解释肌上皮细胞及其突起所构成的紧密包围着腺泡的篮形结构并没有成为水流通过的显著障碍的现象［9］。

SS动物模型的研究目前主要局限于鼠类，尚无大型动物的研究报道。Dean等最初应用Wistar大鼠颌下腺和舌下腺匀浆加完全弗氏佐剂及百日咳杆菌免疫LEW大鼠，成功诱导了免疫性涎腺炎的发生，并检测到抗涎腺和抗泪腺导管上皮抗体，之后的许多研究在多种不同品系的鼠种均成功诱导了SS的发生［10］。诱导型SS的动物模型主要在腺体的局部模拟了人类SS的表现，为SS发病机制的研究及治疗提供了实验方法。本实验结果显示，SS模型小鼠颌下腺AQP1表达与空白组无明显差异，表明此造模方法用于AQP1的观察效果不好。而SS模型小鼠颌下腺中AQP5表达有非常显著的改变，较空白组明显下降，说明诱导型SS造模方法用于观察AQP5的变化是可行的。

［1］李菁，赵岩，唐福林.水分子通道蛋白在干燥综合征发病机制中的作用［J］.中华风湿病学杂志，2004，8(2):105-107.

［2］肖林，杨军，暨兴华，等.干燥综合征动物模型的建立［J］.重庆医学，2003，32(3):306-309.

［3］杨军，杨彦春.腺病毒介导AQP1基因治疗涎腺干燥综合征的实验研究［J］.重庆医学，2005，34(3):323-325.

［4］Kim SW，Lee JU，Nah MY，et al.Cisplatin decreases the abundance of aquaporin water channels in rat kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12(5):875-882.

［5］王云，王礼文.免疫细胞及细胞因子在类风湿性关节炎中的致病机制研究进展［J］.中国康复医学杂志，2007，22(4):370-373.

［6］杨宝学，赵雪俭.水通道蛋白研究进展［J］.中国病理生理杂志，2005，21(8):1619-1622.

［7］Rehman HU.Sjogren’s syndrome［J］.Yonsei Med J，2003，44(6):947-954.

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［9］Gresz V，Kwon TH，Hurley PT，etal.Identification and localization of aquaporin water channels in human salivary glands［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，281(1):G247-254.

［10］陈海英，栗占国.干燥综合征动物模型的研究与应用现状［J］.中华风湿病学杂志，2004，8(8):493-496.