HPLC法测定癌痛巴布剂中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱

李智勇， 邓亚利， 孙冬梅

(1.广东省中医研究所广东广州 510095;2.华南农业大学制药工程系，广东 广州 510642)

癌痛巴布剂是在中医药"内病外治"理论的指导下，将传统中医药和现代经皮给药理论相结合而研发的一种治疗癌痛的中药复方经皮给药制剂。癌痛巴布剂由草乌、生天南星、赤芍、乳香、生姜等药物组成，原为广东省第二中医院临床实践应用于治疗各种恶性肿瘤所致疼痛的经验处方，具有温经通络、消瘤止痛的功效，主要用于寒凝经脉、瘀血阻滞引起的癌症疼痛。本实验采用HPLC同时测定癌痛巴布剂中君药草乌的主要有效成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，为癌痛巴布剂的质量控制和保障临床用药安全提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国);VWD检测器;电子天平BP-211D(Sartorius，德国)。癌痛巴布剂(批号:090916、090917、090918)(自制)。乌头碱对照品(aconetine)(110720-200410)、次乌头碱对照品(hyaconitine)(798-9403)、新乌头碱对照品(mesaconitine)(799-9403)，均购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Elipse CDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相 乙腈-0.2% 冰乙酸(加三乙胺调节pH值为6.25)(29∶71);体积流量1.0 mL/min;检测波长235 nm;柱温30℃。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品适量，加0.01 mol/L盐酸甲醇溶液制成每1 mL含乌头碱26.8 μg、次 乌 头 碱 72.6 μg、新 乌 头 碱 对 照 品163.2μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品3片，除去盖衬，剪碎，混匀，精密称取约0.5片癌痛巴布剂，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，超声处理30 min，过滤，药渣再加入无水乙醇50 mL，超声处理30 min，过滤，合并，滤液挥干，残渣加10 mL 0.6 mol/L的盐酸转入分液漏斗中，加入乙醚萃取3次(20 mL，10 mL，10 mL)，取酸水层，加氨试液调pH值至9，加乙醚萃取3次(10 mL，10 mL，10 mL)，合并乙醚溶液，蒸干，加0.01 mol/L的盐酸甲醇溶液溶解，转入25 mL量瓶中并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 按癌痛巴布剂的制备工艺制备缺草乌的阴性对照制剂，并按供试品溶液制备方法制成草乌阴性样品溶液，按2.1项色谱方法测试，结果供试品中其他杂质峰亦不干扰各待测成分的测定，且分离理想，空白无干扰。见图1～3。

图1 新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of aconitine，mesaconitine and hypaconitine

图2 癌痛巴布剂HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of Aitong Cataplasm

图3 阴性样品HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of negative sample

2.4.2 线性关系考察 精密吸取上述乌头碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品溶液 2、4、6、8、10、12μL进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线:乌头碱:Y=1.173 9X+1.833 1，r=1;次乌头碱:Y=1.265 1X+1.521，r=1;新乌头碱:Y=1.272 4X+5.026 9，r=1，表明乌头碱在 53.6 ～321.6 ng 进样量范围内线性关系良好，次乌头碱在145.2～871.2 ng进样量范围内线性关系良好，新乌头碱在326.4～1 598.4ng进样量范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 精密吸取上述乌头碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品溶液10μL，重复进样5次，测得峰面积积分值 RSD分别为0.43%，0.11%，0.10%。

2.4.4 稳定性试验 取癌痛巴布剂(批号:090916)，按样品制备方法制成供试品液，分别在0、2、4、6、8h不同时间间隔进样 10μL 测定，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积积分值，RSD分别为0.76%，0.62%，0.46%，表明乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在8 h内均稳定。

2.4.5 重复性试验 按拟定的测定方法，对同一批样品(批号:090916)分别制备供试液，共平行制备5份，测得峰面积并计算供试品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱量，结果 RSD分别为 1.93%，1.81%，1.44%，表明重复性良好。

2.4.6 回收率试验 取已测定的样品(批号090916，每片平均含乌头碱0.83 mg，次乌头碱0.87 mg，新乌头碱 7.54 mg，每片平均质量为 11.583 6 g)，分别精密加入一定量的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品，按供试品制备与测定方法，以2.1项色谱条件测定，平行做6组，结果见表1。

表1 乌头碱、次乌头碱、新乌头碱加样回收率测定结果(n=6)Tab.1 Results of recovery test of aconitine，mesaconitine and hypaconitine(n=6)

2.4.7 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表2。

表2 癌痛巴布剂中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱测定结果(n=3)Tab.2 Determination of aconitine，mesaconitine and hypaconitine in Aitong Cataplasm(n=3)

3 讨论

3.1 测定指标的选择 癌痛巴布剂为临床实践应用于治疗各种恶性肿瘤所致疼痛的经验方剂，草乌为君药之一，其中所含乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、N-脱酸刺乌头碱、滇乌头碱等双酯型二萜生物碱是其镇痛麻醉的主要活性成分，以乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的量最高［1-4］。由于酸性染料比色法供试品溶液处理繁杂，并且最终需要进行脱水处理，否则将会对测定结果产生影响［5-7］。因此本试验通过建立癌痛巴布剂中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的HPLC测定方法，为癌痛巴布剂的质量控制和临床用药提供了依据。

3.2 提取方法的选择 乌头碱类成分在碱性条件下不稳定，尤其不适宜采用碱性溶剂例如甲醇、氨水浸泡等进行处理，本试验曾采用纯水、含水甲醇和不同浓度的乙醇作为溶剂进行提取，结果显示，加热后易使供试品膏体溶化，不易滤过，结果显示，宜采用无水乙醇超声处理提取，采用酸提碱沉法进行纯化处理制备供试品;经过方法学考察显示，加无水乙醇超声处理2次，每次30 min，乌头碱总碱的量即不再增加。在酸水溶解除杂过程中，曾采用加氨试液调pH值至8后以乙醚萃取，但由于乌头总碱多处于离子状态而不易被萃取出来，又由于乌头碱在过强碱性条件下不稳定，故将pH调至9，效果较好。

3.3 流动相的选择 文献报道［8-11］乌头碱定量测定多以甲醇和乙酸铵、三乙胺等调节pH值后为流动相，一般不易使乌头碱、次乌头碱、和新乌头碱分离，或是色谱峰易产生拖尾、塌峰等现象，本研究采用乙腈 －0.2%冰乙酸(加三乙胺调节 pH值为6.25)为流动相，经过调节不同的比例，结果在比例为29∶71时即可使三者完全分离，峰形良好，并且阴性无干扰。

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